一种检测TP53基因点突变方法及其试剂盒技术

本发明专利技术属于基因突变检测领域，具体涉及一种高敏感性的TP53基因点突变检测方法及其试剂盒。该方法包括以下步骤：1）按照常规技术提取DNA；2）然后配置含有特异性引物对、DNA聚合酶、PCR常规组件的PCR反应体系；3）对步骤1）所得DNA进行PCR扩增，并对PCR产物进行分析，判断是否发生突变；其中特异性引物对中正义引物的倒数第二个碱基为硫代修饰的碱基；所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶Pfu；本发明专利技术具有快速，特异性高，可靠性高，灵敏，条件依赖少，适用平台广等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因突变检测领域，具体涉及一种高敏感性的TP53基因点突变检测方法及其试剂盒。
技术介绍
TP53基因(gene)在1979年发现，是迄今为止与肿瘤相关性最强的基因之一。该 基因位于17号染色体(chromosome)，其蛋白(protein)产物具有转录(transcription )因 子的功能。TP53蛋白所控制的基因参与细胞分裂与生存过程。与其它肿瘤抑制基因一样， TP53蛋白的功能是阻止细胞生长的失控。TP53蛋白与DNA有直接的相互作用，与其它支配细胞行为方式的蛋白亦有相互作 用。当发现DNA受损或其它细胞受损时，TP53立即启动细胞凋亡(apoptosis)机制。TP53 蛋白在维持细胞正常调控方面起着关键性作用，约半数的肿瘤，不论其类型或起源如何，都 存在TP53基因的缺陷。在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中， 单碱基点突变占了相当大的比例，特别是对已知有义突变的检测，其检测方法的探索一直 是基因诊断研究中的重要课题。基于PCR扩增基础上的突变检测技术，可一定程度上克服 检测靶DNA (目的DNA)含量和/或突变靶序列比例过低、检测灵敏度不足的难题。在过去 十多年中，曾出现了诸如经典的PCR-RFLP、ASO以及OLA、COP、PEX等点突变的检测方法。目前可用的高敏感突变分析方法主要有两类(1)美国NIH国家肿瘤中心Dr. Sommer实验室开发的焦磷酸水解激活的DNA聚合反应技术系列；(2)基于单分子扩增的新 一代测序技术。方法(1)中技术虽然较现有的突变检测方法敏感，但其所需无活性引物昂 贵，敏感性仍偏低，对单一拷贝的DNA分子常需40-50个PCR循环，且该方法对突变识别存 在序列歧视现象，即Taq酶的焦磷酸水解活性不能水解某些特定序列因而难以结合惰性引 物，故无或甚少发生与之偶连的DNA聚合反应。而方法(2)虽然具有高敏感和可靠的特征， 但新一代测序技术在技术上尚有待成熟，且其依赖昂贵的设备和检测过程较长等因素，目 前仍局限于实验研究而未能实际应用于临床诊断。因此，需要研发一种高敏感性的检测TP53基因点突变方法。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种高敏感性的检测TP53基因点突变方法。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是一种高敏感性的检测TP53基因 点突变方法，包括以下步骤1)按照常规技术提取DNA;2)配置含有特异性引物对、高保真DNA聚合酶(PfuDNA聚合酶)、PCR常规组件的PCR 反应体系；3)对步骤1)所得DNA进行PCR扩增，并对PCR产物进行分析，判断是否发生突变；其中，步骤2)中所述特异性引物对选自下述三对特异性引物对 特异性引物对1由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO: 1和反义引物SEQ ID N0:2构成； 特异性引物对2由硫代修饰的正义引物SEQ ID N0:3和反义引物SEQ ID N0:4构成； 特异性引物对3由硫代修饰的正义引物SEQ ID N0:5和反义引物SEQ ID NO:6构成； 其中正义引物SEQ ID NO: 1、正义引物SEQ ID NO:3和正义引物SEQ ID NO:5的倒数 第二个碱基为硫代修饰的碱基，例如SEQ ID NO: 1 5' -ACATGACGGAGGTTGTGAGGCAT-3'中， A碱基为硫代修饰的碱基；所述DNA聚合酶为Pfu DNA聚合酶，属高保真DNA聚合酶；所述PCR常规组件包括dNTP混合液、含镁离子的PCR反应缓冲液、去离子水。上述技术方案中，具体步骤2)中，每20 μ LPCR反应体系中的组分如下正义引物0. 5 μ L，反义引物0. 5 μ L，模板DNA 1 μ L，10 XPfu缓冲液(含硫酸镁》μ L， dNTP混合液(每种IOmM) 0. 4 μ L，高保真DNA聚合酶Pfu 0. 2 μ L，余量为去离子水；其中， dNTP终浓度为200 μ M/L，Pfu 1U，每条引物终浓度为250ρΜ,模板浓度约为0.1ygo上述技术方案中，步骤3)中，PCR反应的条件为94°C :3min，94°C 20s, 60°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min ;30 个循环。上述技术方案中，步骤3)中，对PCR产物进行分析，判断是否发生突变的方法具 体为采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳，如果观察到泳带中出现 180-250bp的DNA条带时，则判定相应引物对应的DNA片段存在相应的点突变。上述技术方案中，所述TP53基因点突变的突变热点为密码子175 (由CGC突变为 CAC)、密码子248 (由CGG突变为CAG)、密码子273 (由CGT突变为TGT)，其中特异性引物对 1是针对密码子175设计的，扩增得到的PCR产物大小为250bp ；特异性引物对2是针对密 码子248设计的，扩增得到的PCR产物大小为188bp ；特异性引物对3是针对密码子273设 计的，扩增得到的PCR产物大小为MObp。优选的技术方案中，采用多重PCR技术，应用上述三对特异性引物一次性扩增3个 位点，提高检测效率。本专利技术同时要求保护一种检测TP53基因点突变的试剂盒，所述试剂盒包括特异 性引物对、DNA聚合酶、PCR常规组件；其中，所述特异性引物对包括特异性引物对1、特异性引物对2、特异性引物对3，其中， 特异性引物对1由硫代修饰的正义引物SEQ ID NO: 1和反义引物SEQ ID N0:2构成；特异 性引物对2由硫代修饰的正义引物SEQ ID N0:3和反义引物SEQ ID N0:4构成；特异性引 物对3由硫代修饰的正义引物SEQ ID N0:5和反义引物SEQ ID N0:6构成；并且，正义引物 SEQ ID N0:1、正义引物SEQ ID N0:3和正义引物SEQ ID N0:5的倒数第二个碱基为硫代修 饰的碱基；所述DNA聚合酶为高保真DNA聚合酶(Pfu)；所述PCR常规组件包括dNTP混合液、含镁离子的PCR反应缓冲液、去离子水。本专利技术的原理是本专利技术利用高保真酶介导的分子开关检测突变，因为对硫化磷 酸修饰的碱基特异性引物而言，高保真聚合酶分子中的聚合中心和3' —5'外切酶酶解中 心既合作又独立地起到了复合分子开关中“开”和“关”的效能。对于配对的引物，则直接 在该酶的聚合中心进行DNA聚合反应；而对于三末端错配的引物，则从该酶的聚合中心转移至3’ 一5’外切酶的酶解中心，由于其修饰了的三末端耐外切酶的特点，继而出现了一种 长时间无酶解产物的酶解过程，最后因酶的聚合中心空转而“关”闭DNA聚合反应。这种配 对引物被延伸，而不配对引物则不被延伸的二元化效果，完美地满足了突变分析时需要对 特定位点进行非此即彼的二元化辨认。由于上述技术方案运用，本专利技术与现有技术相比具有下列优点1)快速，1-2小时 内可快速诊断；2)特异PCR中采用的高保真聚合酶较普通PCR使用的低保真聚合酶识别 效率高出两个数量级，大大提高了 PCR的识别特异性；3)可靠性高高保真聚合酶分子的 3' -5'外切酶活性及高识别效率，大大降低了低保真DNA聚合酶产生的较高假阳性；4) 灵敏PCR技术本身具有的高扩增效率；5)条件依赖少操作本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种检测ＴＰ５３基因点突变方法，包括以下步骤：１）　按照常规技术提取ＤＮＡ；２）　配置含有特异性引物对、ＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ常规组件的ＰＣＲ反应体系；３）　对步骤１）所得ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ产物进行分析，判断是否发生突变；其特征在于，步骤２）中所述特异性引物对选自下述三对特异性引物对：特异性引物对１由硫代修饰的正义引物ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１和反义引物ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２构成；特异性引物对２由硫代修饰的正义引物ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３和反义引物ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４构成；特异性引物对３由硫代修饰的正义引物ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５和反义引物ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６构成；其中正义引物ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１、正义引物ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３和正义引物ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５的倒数第二个碱基为硫代修饰的碱基；所述ＤＮＡ聚合酶为高保真ＤＮＡ聚合酶Ｐｆｕ；所述ＰＣＲ常规组件包括：ｄＮＴＰ混合液、含镁离子的ＰＣＲ反应缓冲液、去离子水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙万平，王伟大，肖莉，李凯，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32