本发明专利技术公开了一种棉花真叶直接分化组织培养方法及其专用培养基。本发明专利技术提供的专用培养基是棉花叶片直接分化出胚性愈伤组织时所用的培养基，它是在ＭＳＢ１基本培养液中，添加如下物质得到的培养基：ＫＴ、６－ＢＡ、２，４－Ｄ，ＩＡＡ，葡萄糖和凝胶剂；上述ＫＴ的终浓度是０．００５－０．１５ｍｇ／Ｌ、６－ＢＡ终浓度是０．００５－０．１５ｍｇ／Ｌ、２，４－Ｄ的终浓度是０．０００１－０．００１ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ的终浓度是０．００１－０．０２ｍｇ／Ｌ、葡萄糖的终浓度是２５－３５ｇ／Ｌ、Ｇｅｌ ｒｉｔｅ的终浓度是１．８－２．５ｇ／Ｌ。本发明专利技术的方法是利用田间棉株的叶片作为外植体建立组织培养体系，最终建立叶片直接诱导胚性愈伤组织的、稳定高效的组织培养体系。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种植物组织培养领域，特别涉及一种大田棉花植株真叶组织培养方 法其专用培养基。
技术介绍
棉花组织培养中，体细胞胚发生和植株再生可分为4步外植体脱分化诱导出愈 伤组织、愈伤组织再分化为胚性愈伤组织、胚性愈伤组织培养出体细胞胚、体细胞胚萌发获 得植株再生。从外植体脱分化生长出愈伤组织比较容易，没见受基因型限制的报道。从愈 伤组织诱导分化出胚性愈伤组织，是棉花组织培养的瓶颈，受基因型限制的报道集中在胚 性愈伤组织的诱导阶段。基因型限制，首先表现在棉属中不同棉种的体细胞胚发生和植株再生能力不同。 研究人员通过对多个棉种进行比较发现，只有陆地棉、雷蒙德氏棉、夏威夷棉能形成体细胞 胚。董合忠和陈志贤比较了 4个棉花栽培种的体细胞胚发生能力，发现陆地棉较易诱导体 细胞胚，亚洲棉次之，海岛棉和非洲棉较差(董合忠1991 ；陈志贤，李淑君.1987)。棉属共 有50个种，包括45个野生种，4个栽培种，迄今为止仅克劳茨基棉、戴维逊氏棉、陆地棉、海 岛棉、亚洲棉、草棉、雷蒙德氏棉和夏威夷棉8个种获得了体细胞胚，其中陆地棉、海岛棉、 亚洲棉、草棉和戴维逊氏棉获得了再生植株。此外，在体细胞胚发生和植株再生能力上，各个棉花品种间也存在差异。 Trolinder对陆地棉28个品种进行了研究，结果只有珂字312和T25具有较高的体细胞胚 发生能力，而其它品种较难或不能进行体细胞胚发生(Trolinder N L5Xhixian C.)。董合 忠等根据胚性愈伤组织成胚数量和发育成植株的多少将陆地棉品种分为四类第一类是体 细胞发生能力强，易成苗的品种，如珂字312、珂字201等；第二类是具有一定的体细胞胚 发生能力，成苗数量中等，经多次继代筛选后可得到较多的体细胞胚和部分再生植株，如岱 字15、岱字16等；第三类是体细胞胚发生能力差，畸形胚多，经长时间继代筛选后方可得到 个别植株，如鲁棉1号、7号等；第四类是体细胞胚极难或不能发生，如斯字棉215、斯字506 等。棉花种质资源丰富，目前仅珂字棉系列，中棉系列、鲁棉系列等少数品种获得了体细胞 胚和再生植株。研究表明陆地棉不同外植体类型之间在愈伤组织诱导和分化方面存在极大差异。 因此，棉花组织培养体系的改良与外植体的筛选，历来是组织培养工作者的研究重点之一。 棉花下胚轴比子叶或叶作外植体优越(Troloinder等1988)。子叶节附近是下胚轴最易形 成愈伤组织的部分(Finerl984，张献龙等1990)。Finer等(1984)发现用成熟棉株的茎、 叶、叶柄作外植体与用无菌苗相比，难以诱导愈伤组织。谭晓连等(1988)研究了盆栽拟似 棉的叶、叶柄和茎在离体培养中的反应，发现采用茎最容易诱导体细胞胚胎发生和植株再 生。未授粉胚珠产生的愈伤组织不如授粉胚珠(宋平，1987)。外植体的放置方向很重要， 利用下胚轴作外植体时，必须使表皮与培养基接触，若使切口与培养基接触，会产生生长缓 慢的红色愈伤组织(Price等)。下胚轴最易，中胚轴和上胚轴次之，子叶较差，叶片和茎段最差，近年来研究毛根能够再生，但难易程度缺少比较(焦改丽等，200 ；张海等Q002)报 道了棉花子叶离体培养与植株再生，但再生频率不高。不同研究者得出的结论有一定差异，可能与不同遗传型材料对诱导培养体系存在 较大的差异有关。而总的来说，幼嫩组织比成熟组织易诱导棉花体细胞胚胎发生(迟吉娜， 等2004)。张朝军等建立了棉花大田叶柄组织培养体系，并利用叶柄组织培养体系选育了高 分化率材料(专利号ZL200610089439. 1)。利用大田成熟植株组织或器官作为外植体建立 组织培养体系，是棉花组织培养研究的热点之一。目前应用于棉花愈伤组织诱导的基本培养基很多，如MS，LS, White, BT, BS, Hitsch，CM-l，SM，KM，P等，但以MS和LS应用较多。棉花不同外植体的组织培养用培养基， 主要是基于MS培养基进行改良。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基。本专利技术提供的棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基，是在MSBl基本培养液 中添加如下物质得到的培养基KT、6-BA、2，4-D，IAA，碳源和凝胶剂；所述培养基中KT的终浓度是0. 005-0. 15mg/L、6-BA终浓度是0. 005-0. 15mg/L、2， 4-D 的终浓度是 0. 0001-0. 001mg/L、IAA 的终浓度是 0. 001-0. 02mg/L。上述MSBl基本培养液是将硝酸铵减半、硝酸钾增加一半的MS培养基的无机盐与 B5培养基的有机成分组成，其溶剂是水，溶质见表1。表1. MSBl基本培养液的溶质KNO3 NH4NO3 MgS04.7H20KH2PO4 CaCl2.2H20 微量元素 FeS04-7H20 MnSO4H2OΓ ZnS04.7H20H3BO3 KINaMn04-2H20 CuS04.5H20 CoC1.6H20有机成分 VB1 VB6烟酸 肌醇大量元素培养基中浓度(g·!/1)2.85 0.825 0.37 0.17 0.44培养基中浓度(mgt1) 746 16.900 8.600 6.200 0.830 0.250 0.025 0.025培养基中浓度(mg·!/1) 10.0 1.0 1.0_100.0_上述凝胶剂可以是琼脂粉、卡拉胶或Gel rite等组织培养常用固化剂，优选的是 美国Sigma公司生产的Gel rite (sigma公司生产，货号是G1910)。当然也可以是琼脂粉， 用量是6. 5-7.0克/L，也可以是卡拉胶等组织培养常用凝胶剂，用量以2. 2g/L Gel rite能 达到的培养基硬度为基础，适当调整用量。上述碳源可以是葡萄糖或蔗糖，胚性愈伤组织诱导阶段用葡萄糖，胚状体萌发阶 段用蔗糖。进一步，上述棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基中KT为0. 005-0. 15mg/L、 6-BA 为 0. 005-0. 15mg/L、2，4-D 为 0. 0001-0. 001mg/L, IAA 为 0. 001-0. 02mg/L,葡萄糖为 25-35g/L和 Gel rite 为 1.8-2. 5g/L。最优地，棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基中KT为0. 05mg/L、6_BA为 0. lmg/L、2，4-D 为 0. 005mg/L, IAA 为 0. 005mg/L,葡萄糖为 25g/L 和 Gel rite 为 2. 2g/L。本专利技术的另一目的在于提供一种生产棉花再生苗的方法。本专利技术提供的生产棉花再生苗的方法，包括以下步骤1)将棉花叶片置于上述的棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基中培养，得到 胚性愈伤组织；2)将步骤1)得到的胚性愈伤组织在胚状体萌发培养基中继代培养，获得胚状体， 得到棉花再生苗。上述的胚状体萌发培养基，是在MSBl基本培养液中，添加KT、6_BA、蔗糖和Gelrite得到的培养基，所述MSBl基本培养液溶剂是水，溶质见表1。所述胚状体萌发培养基中KT的终浓度是0.001-0. 15mg/L,6-BA的终浓度为 0. 005-0. 15mg/L，蔗糖 25_35g/L，Gel rite 的终浓度是 2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基，是在ＭＳＢ１基本培养液中添加如下物质得到的培养基：ＫＴ、６－ＢＡ、２，４－Ｄ、ＩＡＡ、碳源和凝胶剂；所述ＭＳＢ１基本培养液的溶剂是水、溶质如表１所示；所述培养基中ＫＴ的终浓度是０．００５－０．１５ｍｇ／Ｌ、６－ＢＡ终浓度是０．００５－０．１５ｍｇ／Ｌ、２，４－Ｄ的终浓度是０．０００１－０．００１ｍｇ／Ｌ、ＩＡＡ的终浓度是０．００１－０．０２ｍｇ／Ｌ。
【技术特征摘要】
1.一种棉花叶片直接诱导胚性愈伤组织的培养基，是在MSBl基本培养液中添加如下 物质得到的培养基KT、6-BA、2，4-D、IAA、碳源和凝胶剂；所述MSBl基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述培养基中KT的终浓度是0. 005-0. 15mg/L、6-BA终浓度是0. 005-0. 15mg/L、2，4_D 的终浓度是 0. 0001-0. 001mg/L、IAA 的终浓度是 0. 001-0. 02mg/L。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述凝胶剂是琼脂粉、卡拉胶或Gel rite，优选是Gel rite ；所述碳源是葡萄糖或蔗糖。3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于所述培养基中KT、6-BA、2，4-D、IAA、葡 萄糖与Gel rite的终浓度分别是如下1)或2)1)KT为 0. 005-0. 15mg/L、6-BA 为 0. 005-0. 15mg/L、2，4-D 为 0. 0001-0. 001mg/L，IAA 为 0. 001-0. 02mg/L,葡萄糖为 25_35g/L 和 Gel rite 为 1. 8-2. 5g/L ；2)KT 为 0. 05mg/L、6-BA 为 0. lmg/L、2，4_D 为 0. 005mg/L, IAA 为 0. 005mg/L，葡萄糖为 25g/L 和 Gel rite 为 2. 2g/L。4.一种生产棉花再生苗的方法，包括以下步骤1)将棉花叶片置于权利要求1-3任一所述的培养基中培养，得到胚性愈伤组织；2)将步骤1)...
【专利技术属性】
技术研发人员：张朝军，李付广，王晔，王玉芬，武芝侠，李凤莲，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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