植物组织培养脱毒外植体脱毒方法技术

本发明专利技术属于植物脱毒技术领域，特别涉及植物组织培养脱毒外植体脱毒方法。该方法包括以下步骤：选取植物成熟组织，将其进行灭菌处理后于初代培养基进行初代培养，在初代培养的基础上进行增殖培养，在增殖培养的基础上进行病毒检测，挑选病毒阴性的继代苗扩大繁殖量后进行生根培养，至长出良好的根系后驯化、移栽。本发明专利技术采用成熟组织作为外植体，使得组织培养脱毒操作变得更加简单，大大提高分化率和成活率，脱毒的成功率高。

Detoxification method of virus-free explant in plant tissue culture

The present invention belongs to the field of plant detoxication technology, and especially relates to virus-free method for virus-free explant of plant tissue culture. The method comprises the following steps: selection of mature tissue plants, it is sterilized in initial medium for primary culture, proliferation culture based on primary culture, virus detection based on the proliferation, selection of virus negative subculture Miao Kuoda reproduction after rooting, to produce good root after acclimatization and transplantation. The present invention adopts mature tissue as explant, so that tissue culture virus-free operation becomes simpler, and the differentiation rate and survival rate are greatly improved, and the success rate of detoxification is high.

【技术实现步骤摘要】
植物组织培养脱毒外植体脱毒方法
本专利技术属于植物脱毒
，特别涉及植物组织培养脱毒外植体脱毒方法。
技术介绍
病毒对植物危害严重，病毒可导致植物树体衰弱，果实变小并且畸形，品质变劣，产量严重下降，病毒病属于难治疗病害，迄今还没有一种有效的药物可以解决[2-7]。因此，培育无病毒植物苗木已经成为防止病毒危害的主要措施。目前，通常采用的培育无病毒植物苗木的方法是茎尖组织培养技术。茎尖培养可以从植物组织中脱除病毒，形成无病毒(或脱毒)植株。茎尖培养，有时也称微茎尖培养，其利用茎尖为分生组织，其中无病毒的原理，通过组织培养实现脱除病毒的目的。但茎尖大小对成活率和脱毒率有很大的影响，茎尖越大，分化率和成活率越大，但脱毒率越低；反之，如果茎尖越小，虽然脱毒率提高了，但分化率和成活率又大大降低，往往外植体死亡，造成组织培养脱毒失败[8-11]。
技术实现思路
为解决现有技术中茎尖脱毒培养法使用的外植体太小而导致脱毒培养失败的问题，本专利技术采用成熟组织[1]作为外植体，使得组织培养脱毒操作变得更加简单，大大提高分化率和成活率，使脱毒的成功率更高。本专利技术的技术构思是：采用成熟组织作为外植体时，首先要诱导出愈伤组织，而愈伤组织中存在部分分生组织，分生组织中是不存在病毒的，因此，通过对愈伤组织的培养就有可以培育出由分生组织分化来的脱毒苗木。本专利技术采用的技术方案如下：植物组织培养脱毒外植体脱毒方法，包括以下步骤：选取植物成熟组织，将其进行灭菌处理后于初代培养基进行初代培养，在初代培养的基础上进行增殖培养，在增殖培养的基础上进行病毒检测，挑选病毒阴性的继代苗扩大繁殖量后进行生根培养，至长出良好的根系后驯化、移栽。进一步的，所述的方法具体为：(1)将休眠季或生长季的植物成熟组织作为外植体用流水清洗，放入30～50wt％大蒜水溶液中灭菌20～40min；(2)灭菌后的外植体立即接种在最适初代培养基中，待诱导出愈伤组织后转移到最适继代培养基中进行增殖培养；(3)待增殖培养的无根苗达到较大数量时，取50～10mg叶片进行病毒检测，将检测结果为阴性的继代苗继续在增殖培养基中培养；(4)待继代苗培养至一定数量后转移至生根培养基中进行生根培养；(5)待长出良好的根系后驯化、移栽。进一步的，所述的植物成熟组织为双子叶植物生长季叶片或休眠季韧皮部或单子叶植物叶片。进一步的，所述的初代培养基包括：0.5～3.0mg/L2,4-D。进一步的，所述继代培养基包括：0.2～1.5mg/L6-BA，0.05～0.5mg/LIBA，0.4～2.0mg/LGA。进一步的，所述生根培养基包括：0.3～2.0mg/LIBA。所述的驯化为：将长出良好的根系转移到珍珠岩和沙土上进行驯化。进一步的，所述步骤(5)中，驯化后将根系移栽在中性土壤中。本专利技术另一个目的是请求保护双子叶植物成熟组织在组织培养脱毒中的应用。本专利技术还请求保护单子叶植物成熟组织在组织培养脱毒中的应用。本专利技术采用成熟组织作为外植体，在脱除植物病毒方面具有如下优势：1、操作极为方便，传统的茎尖培养培育脱毒苗，由于所取外植体太小(一般外植体长度不超过1mm)，工作人员需要在体视显微镜下，才能获取外植体。而且由于外植体太小，用镊子将其接种到培养基上时操作难度大，操作速度慢。而采用成熟组织作为外植体，由于外植体较大，操作方便，无需借助体视显微镜。2、分化率和成活率很高，传统的茎尖培养培育脱毒苗，由于外植体太小，外植体分化为组培苗的难度较大，成苗率自然很低，往往导致接种后的外植体死亡，导致失败。而采用成熟组织作为外植体，分化率和成活率相对很高。3、采用成熟组织作为外植体，即使生成极少量的脱毒苗，也可以通过组培快速地繁殖起来，不影响脱毒培养。附图说明图1为红富士苹果ACLSVRT-PCR产物电泳图；图2为蝴蝶兰CyMVRT-PCR产物电泳图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但本专利技术不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述试验方法如无特殊说明，均为常规方法；如无特殊说明，所述试剂和生物材料，均可从商业途径获得。实施例1选双子叶植物“红富士”苹果生长期的叶片作为外植体，流水冲洗后，放入到30％大蒜水溶液灭菌30min，然后剪成1㎝2的正方形，立即接种在最适初代培养基中(MS+2,4-D1.0mg/L+3％蔗糖+琼脂8g/L)上。待诱导出愈伤组织后转移到最适继代培养基(2/3MS+6-BA0.6mg/L+IBA0.2mg/L+GA1.0+3％蔗糖+8g/L琼脂)中培养，不断地进行增殖培养，待继代培养的无根苗达到较大数量时，取50～100mg叶片进行主要病毒的检测。本次检测的病毒是苹果主要病毒之一，即苹果褪绿叶斑病毒(Applechloroticleafspotvirus,ACLSV)，如图1所示电泳图中没有出现长度为358bp病毒特异性片段，即检测结果为阴性，将检测结果为阴性的继代苗继续在增殖培养基中培养，到一定数量后再将其转到适宜的生根培养基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+8g/L琼脂)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中，脱毒成功率能达到4.2～5.7％。实施例2：选双子叶植物“红富士”苹果休眠期的韧皮部作为外植体，流水冲洗后，放入到50％大蒜水溶液灭菌30min，立即接种在最适初代培养基中(MS+2,4-D1.5mg/L+3％蔗糖+琼脂8g/L)上。待诱导出愈伤组织后转移到最适继代培养基(2/3MS+6-BA0.6mg/L+IBA0.2mg/L+GA1.0+3％蔗糖+8g/L琼脂)中培养，不断地进行增殖培养，待继代培养的无根苗达到较大数量时，取50～100mg叶片进行主要病毒ACLSV的检测。然后将检测结果为阴性(即电泳图1中没有出现长度为358bp病毒特异性片段)的继代苗继续在增殖培养基中培养，到一定数量后再将其转到适宜的生根培养基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+8g/L琼脂)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中，脱毒成功率能达到4.6～6.2％。实施例3：选单子叶植物蝴蝶兰的叶片，流水冲洗后，浸泡在30％大蒜溶液中30min，然后剪成1㎝2的正方形片状，立即接种在最适初代培养基中(MS+2,4-D1.0mg/L+BA1.0mg/L+3％蔗糖+琼脂8g/L)上。待诱导出愈伤组织后转移到最适继代培养基(MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L+3％蔗糖+8g/L琼脂)中培养，不断地进行增殖培养，待继代培养的无根苗达到较大数量时，取50～100mg叶片进行主要病毒的检测。本次检测的病毒是蝴蝶兰主要病毒之一，即建兰花叶病毒(Cymbidiummosaicvirus,CyMV)。然后将检测结果为阴性(即电泳图2中没有出现长度为431bp病毒特异性片段)的继代苗继续在增殖培养基中培养，到一定数量后再将其转到适宜的生根培养基中(1/2MS+BA0.2mg/L+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+8g/L琼脂)中进行生根培养，至长出良好的根系后转移到珍珠岩和沙土上进行驯化，最后移栽在中性壤土中，脱毒成功率能达到6.4～7.3％。试验例：一.红富士苹果本文档来自技高网...

【技术保护点】
植物组织培养脱毒外植体脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤：选取植物成熟组织，将其进行灭菌处理后于初代培养基进行初代培养，在初代培养的基础上进行增殖培养，在增殖培养的基础上进行病毒检测，挑选病毒阴性的继代苗扩大繁殖量后进行生根培养，至长出良好的根系后驯化、移栽。

【技术特征摘要】
1.植物组织培养脱毒外植体脱毒方法，其特征在于，包括以下步骤：选取植物成熟组织，将其进行灭菌处理后于初代培养基进行初代培养，在初代培养的基础上进行增殖培养，在增殖培养的基础上进行病毒检测，挑选病毒阴性的继代苗扩大繁殖量后进行生根培养，至长出良好的根系后驯化、移栽。2.根据权利要求1所述的植物组织培养脱毒外植体脱毒方法，其特征在于，所述的方法具体为：(1)将休眠季或生长季的植物成熟组织用流水清洗，放入30～50wt％大蒜水溶液中灭菌20～40min；(2)灭菌后的外植体立即接种在初代培养基中，待诱导出愈伤组织后转移到继代培养基中进行增殖培养；(3)待增殖培养的无根苗达到较大数量时，取50～10mg叶片进行病毒检测，将检测结果为阴性的继代苗继续在增殖培养基中培养；(4)待继代苗培养至一定数量后转移至生根培养基中进行生根培养；(5)待长出良好的根系后驯化、移栽。3.根据权利要求1所述的植物组织培养脱毒外植体脱毒方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯义龙，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21