本发明专利技术公开了一种棉花的组织培养方法及其应用。其目的是提供一种棉花的组织培养方法及其在筛选高分化率棉花株系中的应用。培养方法包括以下步骤：（１）以经灭菌的叶柄为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；（２）将愈伤组织置于分化培养基上进行分化培养；（３）将分化出的胚性愈伤组织在胚状体萌发成苗培养基上培养获得再生植株。该培养方法以叶柄为外植体，不仅分化率高，而且可用于高分化率棉花株系的筛选，筛选方法简单、周期短，可以进行推广应用。此外，筛选到的高分化率棉花还可以大幅度提高农杆菌介导法的转化效率，缩短转化周期。本发明专利技术将在棉花的组培、选育及其品种改良中发挥重要作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种棉花的组织培养方法及其应用，特别是涉及一种棉花的组织培养方法及其在筛选高分化率棉花株系中的应用。
技术介绍
基因型对棉花体细胞胚发生和植株再生能力具有决定性作用。首先表现在棉属中不同棉种的体细胞胚发生和植株再生能力不同。研究人员通过对多个棉种进行比较发现，只有陆地棉、雷蒙德氏棉、夏威夷棉能形成体细胞胚。董合忠和陈志贤比较了4个棉花栽培种的体细胞胚发生能力，发现陆地棉较易诱导体细胞胚，亚洲棉次之，海岛棉和非洲棉较差(董合忠.不同基因型棉花下胚轴离体培养胚状体发生的研究。莱阳农学院学报，1991，97-101和陈志贤，李淑君.棉花细胞悬浮培养胚胎发生和植株再生某些特性的研究.中国农业科学，1987，20(5)6-11)。棉属共有50个种，包括45个野生种，4个栽培种，迄今为止仅克劳茨基棉、戴维逊氏棉、陆地棉、海岛棉、亚洲棉、草棉、雷蒙德氏棉和夏威夷棉8个种获得了体细胞胚，其中陆地棉、海岛棉、亚洲棉、草棉和戴维逊氏棉获得了再生植株。此外，在体细胞胚发生和植株再生能力上，各个棉花品种间也存在差异。Trolinder对陆地棉28个品种进行了研究，结果只有珂字312和T25具有较高的体细胞胚发生能力，而其它品种较难或不能进行体细胞胚发生(Trolinder N L，Xhixian C.Genotypespecificity of the somatic embryogenesis response in cotton.Plant Cell Rep，1989，8133-136)。董合忠等根据成胚数量和发育成植株的多少将陆地棉品种分为四类第一类是体细胞发生能力强，易成苗的品种，如珂字312、珂字201等；第二类是具有一定的体细胞胚发生能力，成苗数量中等，经多次继代筛选后可得到较多的体细胞胚和部分再生植株，如岱字15、岱字16等；第三类是体细胞胚发生能力差，畸形胚多，经长时间继代筛选后方可得到个别植株，如鲁棉1号、7号等；第四类是体细胞胚极难或不能发生，如斯字棉215、斯字506等。棉花种质资源丰富，目前仅珂字棉系列，中棉系列、鲁棉系列等少数品种获得了体细胞胚和再生植株。棉花组织培养中常用的外植体均来自无菌苗，一般为无菌苗的子叶、下胚轴，2002年张海申请了无菌苗子叶柄组织培养的专利(利用子叶柄作为外植体的棉花组织培养方法)、2002年焦改丽建立了无菌苗胚根培养体系(焦改丽，李俊峰.利用新的外植体建立棉花高效转化系统的研究。棉花学报2002，10(1)6-9)。在现有培养体系下，取外植体进行组织培养时被培养的个体将不复存在，因此不能用于分化率遗传研究与高分化率材料选育。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种棉花大田叶柄组织培养方法。本专利技术所提供的棉花大田叶柄组织培养方法，包括以下步骤(1)以经灭菌的大田成熟叶柄为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基(命名为MSB1)是在由MS培养基的无机盐配方和B5培养基的维生素配方组成的MSB基本培养基(桂耀林，马诚编著《植物组织培养》，科学出版社，198523-27)的基础上添加了吲哚乙酸(IAA)0.05-0.15mg/L，激动素(KT)0.05-0.15mg/L，2，4-D 0.05-0.15mg/L，葡萄糖25-35g/L，凝胶剂(Gelrite)1.5-2.5mg/L，pH 5.6-6.0；(2)将愈伤组织置于分化培养基上进行分化培养；所述分化培养基(命名为MSB2)是在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.001-0.05mg/L，激动素0.001-0.05mg/L，葡萄糖25-35g/L，凝胶剂1.5-2.5mg/L，pH 6.5-7.0；(3)将分化出的胚性愈伤组织置于胚状体萌发成苗培养基上进行再生成苗培养；所述胚状体萌发成苗培养基(命名为MSB3)是在MSB基本培养基的基础上添加了激动素(KT)0.001-0.05mg/L，6-BA 0.005-0.1mg/L，蔗糖25-35g/L，凝胶剂1.5-2.5mg/L，pH 6.5-7.0。在上述棉花的组织培养方法中，所述对叶柄进行灭菌的方法可为将叶柄浸入质量百分浓度为0.1％的HgCl2溶液中浸泡4-5分钟，然后用无菌水冲洗掉残余的HgCl2。为获得较好的愈伤组织，在培养前先切除叶柄两端的伤口部分，再将剩余部分切成0.4-0.6cm长的小段。优选的培养基配方为步骤(1)中的愈伤组织诱导培养基优选为在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.1mg/L，激动素0.1mg/L，2，4-D 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gelrite 2mg/L，pH 5.8；步骤(2)中的分化培养基优选为在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.005mg/L，激动素0.005mg/L，葡萄糖30g/L，Gelrite2mg/L，pH 6.8；步骤(3)胚状体萌发成苗培养基为在MSB基本培养基的基础上添加了激动素0.01mg/L，6-BA 0.01mg/L，蔗糖30g/L，Gelrite 1.5-2.5mg/L，pH 6.8。上述组织培养方法对所有棉花品种的叶柄均适用，如中棉系列、珂字棉系列或鲁棉系列等，特别适用于中棉所24。本专利技术的第二个目的是提供一种筛选高分化率棉花株系的方法。本专利技术所提供的高分化率棉花株系的筛选方法，包括以下步骤1)以叶柄为外植体，用上述方法进行组织培养，选择分化率达70％以上的高分化率单株，自交后单株收获；2)对高分化率的单株株行种植扩繁、自交，同时以扩繁植株的叶柄为外植体用上述方法进行组织培养，选择分化率达90％以上的高分化率株系。收获用上述筛选方法获得的高分化率株系的种子，用部分种子种植无菌苗，再以无菌苗的下胚轴为外植体进行组织培养，可对高分化率的株系作进一步筛选，选育出叶柄与无菌苗下胚轴均有高分化率的材料。此外，还可将用上述筛选方法获得的高分化率单株与其它品种的棉花进行杂交，在F2代用与上述相同的方法选择高分化率株系，从而进行适合组织培养的棉花材料杂交选育，拓展棉花组织培养的基因型。本专利技术提供了一种棉花的组织培养方法。该培养方法以叶柄为外植体，不仅分化率高，而且可用于高分化率棉花株系的筛选，筛选方法简单、周期短，可以进行推广应用。此外，筛选到的高分化率棉花还可以大幅度提高农杆菌介导法的转化效率，缩短转化周期。本专利技术将在棉花的组培、选育及其品种改良中发挥重要作用。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所述百分浓度如无特别说明均为质量百分浓度。实施例1、中棉所24中高分化率株系的筛选愈伤组织诱导培养基在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.1mg/L，激动素0.1mg/L，2，4-D 0.1mg/L，葡萄糖30g/L，Gelrite 2mg/L，pH 5.8。分化培养基在MSB基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸0.005mg/L，激动素0.005mg/L，葡萄糖30g/L，Gelrite 2mg/L，pH 6.8。胚状体萌发成苗培养基在MSB基本培养基的基础上添加了激动素0.01mg/L，6-BA 0.01mg/L，蔗糖30g/L，Gelrite 1.5-2.5mg/L，pH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种棉花的组织培养方法，包括以下步骤：（１）以经灭菌的大田成熟叶柄为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基是在由ＭＳ培养基的无机盐配方和Ｂ５培养基的维生素配方组成的ＭＳＢ基本培养基的基础上添加了吲哚 乙酸０．０５－０．１５ｍｇ／Ｌ，激动素０．０５－０．１５ｍｇ／Ｌ，２，４－Ｄ０．０５－０．１５ｍｇ／Ｌ，葡萄糖２５－３５ｇ／Ｌ，凝胶剂１．５－２．５ｍｇ／Ｌ，ｐＨ５．６－６．０；（２）将愈伤组织置于分化培养基上进行分化培养；所述 分化培养基是在ＭＳＢ基本培养基的基础上添加了吲哚乙酸０．００１－０．０５ｍｇ／Ｌ，激动素０．００１－０．０５ｍｇ／Ｌ，葡萄糖２５－３５ｇ／Ｌ，凝胶剂１．５－２．５ｍｇ／Ｌ，ｐＨ６．５－７．０；（３）将分化出的胚性愈伤组织置于胚状体萌 发成苗培养基上进行再生成苗培养；所述胚状体萌发成苗培养基是在ＭＳＢ基本培养基的基础上添加了激动素０．００１－０．０５ｍｇ／Ｌ，６－ＢＡ０．００５－０．１ｍｇ／Ｌ，蔗糖２５－３５ｇ／Ｌ，凝胶剂１．５－２．５ｍｇ／Ｌ，ｐＨ６．５－７．０。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张朝军，李付广，喻树讯，范术丽，王玉芬，武芝侠，李凤莲，刘传亮，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：41[中国|河南]
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