黄尾鰤腹水病毒的实时定量RT-PCR快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种黄尾鰤腹水病毒的实时定量ＲＴ－ＰＣＲ快速检测方法，该方法利用正向引物、反向引物和荧光探针并以体外转录ＲＮＡ标准品作为逆转录和扩增的双重对照，可以对黄尾鰤腹水病毒进行定性、定量检测。本发明专利技术具有快速，准确、特异性好、灵敏度高的优点，可以应用于水产养殖场以及检验检疫部门对鱼类病毒的快速检验检疫，也可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景广泛。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水产动物病原的检测技术，涉及一种采用实时定量逆转录-聚合酶链式反应 (reverse transcription-polymerase chain reaction,简称RT-PCR)技术检测鱼类黄尾獅腹水病毒 的方法——黄尾獅腹水病毒的实时定量RT-PCR快速检测方法。
技术介绍
黄尾蛳腹水病毒隶属于双片段RNA病毒科(Birnaviridae)、水生双片段RNA病毒属 (Aquabimavirus),于1985年首次从黄尾鯽(Seriola quinqueradiata)分离到。该病毒可以感染舻 鱼、真鲷、日本比目鱼、琥珀鱼、黄尾鯽等鱼类，目前也已经从贝——日本珍珠贝中分离到 黄尾鯽腹水病毒。黄尾鯽腹水病毒是严重影响海水养殖鱼类的一种传染性疾病的病原，对亚 洲海洋水产养殖业造成了严重的危害。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局与韩国海 洋水产部于2005年发布的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中规定，中国出口到韩国 的鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等主要海水养殖鱼类必须进行黄尾鯽腹水病毒的检验检疫。在一些海水养殖和海洋鱼类消费的主要国家中，也将该病作为重要的检疫对象。目前鱼类病毒的检测方法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断 技术三大类。细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理切片及电镜观察， 其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低；免疫学诊断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂 交，其方法具有特异性强、敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测； 分子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR),比较快速、灵敏，但是需要琼脂糖凝 胶电泳，溴化乙锭染色观察结果，溴化乙锭是致癌物，对人体和环境有危害，并且交叉污染 问题比较严重；另外PCR只能进行定性检测，不能对病毒进行定量检测。黄尾鯽腹水病毒的检测方法目前主要采用细胞学诊断技术。我国水产养殖业和国际贸易 的迅速发展迫切需要建立快速、灵敏、准确的黄尾獅腹水病毒的检测方法，以尽快检测病原 体，打破国外技术壁垒，为国家贸易服务。定量PCR技术目前己被广泛应用于检测水生生物 病原体，如对虾白斑综合症病毒、鱼传染性造血器官坏死病毒、副溶血弧菌等，据检索，目 前尚未见采用实时定量RT-PCR技术检测黄尾鯽腹水病毒的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄尾鯽腹水病毒的实时定量RT-PCR快速检测方法，以克服 现有检测技术的不足，为我国水产养殖业和国际鱼类贸易提供一种快速、简便、高效、实用的检测方法。为了实现上述目的，本专利技术的主要原理是采用荧光探针法实时定量PCR技术，反应体系 中包括一对PCR引物和一条荧光探针，荧光探针可以与靶序列特异性的结合，荧光探针的5' 端标记有荧光报告基团，5'端标记有荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的 能量由于荧光共振能量转移而被淬灭基团吸收，因此反应体系中检测不到荧光信号；在PCR 反应过程中，引物和探针都与模板结合，Taq酶发挥5'-3'外切核酸酶活性，将荧光探针切断 从而使荧光报告基团远离淬灭基团，因此产生可以检测到的荧光信号。随着PCR循环次数的 增加，释放出来的荧光信号不断增加，荧光信号强度与扩增产物的数量呈正比关系，仪器记 录荧光信号强度，最终计算出循环阈值(Thresholdcycle,简称Ct值)。Ct值是指荧光信号由 本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，Ct值与模板的初始拷贝数成反比，初始拷 贝数越多，Ct值越小；利用己知拷贝数的标准品制备出标准曲线，再根据样品的Ct值，可以 对样品中的黄尾獅腹水病毒进行准确的定量检测。 本专利技术的技术方案如下首先设计特异性引物序列和荧光探针序列，然后提取待测样品的RNA，之后配制实时定 量RT-PCR反应体系并按照反应程序进行反应，同时利用体外转录含有目的扩增片段的核糖 核酸(Ribonucleic acid，简称RNA)作为标准品进行反应以绘制标准曲线；最后根据定量PCR 仪得到的待测样品的Ct值來判定待测样品中是否含有黄尾鯽腹水病毒并进行定量。本专利技术所述的设计特异性引物序列和荧光探针序列选取黄尾鲫腹水病毒的衣壳蛋白基 因保守序列，利用已有的Primer Express 2.0软件设计特异性引物序列和荧光探针序列，为 正向引物..5'-GGCTGATCTCACGGAAATACG-3': 反向引物5 '-GTCCCATTCAGGGCATACAGA-3'; 荧光探针5'-FAM-TCCAGAGCTCAACCCTACCCGCTG-TAMRA-3'。荧光探针的5'端标记荧光报告基团6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein,简称FAM)， 3' 端标记荧光淬灭基团6-羧基四甲基罗丹明(6-Carboxytetramethylrhodamine，简称TAMRA)， 扩增片断长度为70bp。本专利技术所述的提取待测样品的RNA:采用传统的TRIZOL法或者商业化的RNA提取试 剂盒提取待测样品的RNA，之后用核酸分析仪进行OD26o/OD28()检测。本专利技术所述的配制实时定量RT-PCR反应体系并按照反应程序进行反应实时定量 RT-PCR反应体系由以下成分组成12.5 jiL 2x实时定量RT-PCR反应液，l-2^L 10tunol/L正 向引物，l-2nLl(Himol/L反向引物，0.5-lpL 10nmol/L荧光探针，l-2^L 100ng/nL待测样品的RNA，补充双蒸水至反应体系总体积为25hL。在PCR反应管中配制好反应体系后，将反 应管放到定量PCR仪器中进行扩增反应，反应程序为48°C-52°C反应30-60min; 95'C反应 10min;之后95。C反应15sec-30sec， 57'C-63'C再反应30sec-lmin;进行40个循环。本专利技术所述的制备体外转录含有目的扩增片段的RNA作为标准品进行定量PCR反应绘 制标准曲线首先将PCR产物电泳后切下含有目的片段的凝胶，用凝胶纯化试剂盒纯化，与 pGEM-T载体4'C过夜连接，转化感受态细胞，转化产物涂平板培养，挑取白斑PCR产物 鉴定阳性后测序，根据测序结果将筛选的阳性克隆接种到含氨苄青霉素的溶菌肉汤培养基， 过夜培养，制备质粒脱氧核糖核酸纯化后，经过NcoI酶切后，利用T7启动子体外转录制备 RNA模板，乙醇沉淀后于紫外分光光度计测定OD26o定量，并梯度稀释，为6xl0气6xl(^拷 贝/^L;将梯度稀释的标准品进行实时定量RT-PCR反应；由定量PCR仪得到标准品的Ct值 (Thresholdcycle,循环阈值)，根据标准品的浓度和Ct值，仪器自动绘制出标准曲线。本专利技术所述的根据待测样品的Ct值来判定待测样品中是否含有黄尾鯽腹水病毒并进行 定量若待测样品的Ct值536.0，则判定待测样品中含有黄尾鯽腹水病毒，而其病毒含量通 过Ct值和标准曲线由定量PCR仪自动计算；若待测样品的Ct值〉36.0，则判定待测样品中不 含有黄尾鲫腹水病毒。本专利技术适用于对黄尾鯽腹水病毒进行快速检测，可广泛应用于鱼类特别是鲈鱼、真鲷等 养殖场的疫病监控及进出口水生动物贸易中黄尾獅腹水病毒的检测。 与现有技术相比，本专利技术的有益本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄尾鰤腹水病毒的实时定量ＲＴ－ＰＣＲ快速检测方法，其特征在于首先设计特异性引物和荧光探针序列，然后提取待测样品的ＲＮＡ，之后配制实时定量ＲＴ－ＰＣＲ反应体系并按照反应程序进行反应，同时利用体外转录含有目的扩增片段的核糖核酸作为标准品进行反应以绘制标准曲线，最后根据待测样品的Ｃｔ值进行结果判定，其中所述的特异性引物序列和荧光探针序列如下：　正向引物：５′－ＧＧＣＴＧＡＴＣＴＣＡＣＧＧＡＡＡＴＡＣＧ－３′；　反向引物：５′－ＧＴＣＣＣＡＴＴＣＡＧＧＧＣＡＴＡＣＡＧ Ａ－３′；　荧光探针：５′－ＦＡＭ－ＴＣＣＡＧＡＧＣＴＣＡＡＣＣＣＴＡＣＣＣＧＣＴＧ－ＴＡＭＲＡ－３′。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：岳志芹，徐彪，刘荭，李琼，肖西志，孙涛，赵巍，辛学谦，邓明俊，凌宗帅，方绍庆，张太翔，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]