本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种肠道病毒７１型的检测试剂盒。本发明专利技术公开了一种肠道病毒７１型核酸扩增荧光定量和液态芯片双检试剂盒，包括：一对５’端标记有生物素ＥＶ７１基因组特异性引物Ａ和Ａ’；一对５’端标记有生物素ＥＶ７１基因组特异性引物Ｂ和Ｂ’；一种交联与引物Ａ和Ａ’扩增片段序列配对的探针Ｆ的荧光编码微球Ｃ；一种交联与引物Ｂ和Ｂ’扩增片段序列配对的探针Ｇ的荧光编码微球Ｄ；一对ＥＶ７１基因组特异性保守序列引物Ｅ和Ｅ’；一条５’端标记荧光基团和３’端标记ＢＨＱ的Ｔａｑ－Ｍａｎ探针；ＱＲＴ－ＰＣＲ试剂和荧光物标记的亲和素。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种肠道病毒71型的检测试剂品-o
技术介绍
肠道病毒 71 型(enterovirus71 ， EV71)是小 RNA病毒科 (Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员。EV71感染主要引起患 者手足口病(HFMD)，并且是该病的主要病原体。另外，EV71还可引起无 菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种神经系统相关疾病， 并可暴发流行，导致死亡，严重危害人类健康。为了在EV71相关疾病暴发时能够迅速査明病因，从而及时采取正确、 有效的控制措施，亟需针对EV71的准确、快速、高灵敏度、高特异性、 高通量的新型诊断手段。肠道病毒感染具有"一因多病， 一病多因"的特 点，仅根据临床症状不易做出正确的诊断。例如，引发手足口病的肠道病 毒就有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、 4、 5、 9、 10型，B组的2、 5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以肠道病 毒71型和柯萨奇病毒A16型(CoxsakieA16，简称CoxA16)最为常见。肠 道病毒的传统检测方法是病毒分离、血清中和试验和分子生物学诊断技 术。病毒分离操作复杂、耗时长、费用高、分离率低。免疫学方法虽然比 分离培养法更加简便、快速，但是整个检测时间仍需1周左右的时间。病 人感染病毒后，血清中产生特异性抗体需要一段时间。另外，EV71感染 后只有2 10天(平均3 5天)的潜伏期，而传染力始于发病的前几天， 所以免疫学方法敏感度较低，尤其不适合早期诊断。毒株抗原变异、抗原 抗体交叉反应、患者个体差异等均在较大程度上影响了该法的准确性与特 异性。近年来，聚合酶链式反应(PCR)技术广泛应用于病毒特异性基因的 检测，尽管它也具有灵敏、特异、快速的优点，但结果判定需要电泳，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。由此可见，目前常用的肠道病毒71型检测手段均存在较大的不足， 不能满足疾病暴发时对大量临床样本，尤其是早期样本准确、快速诊断的 要求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是现有肠道病毒71型检测手段均存在较 大的不足的问题为了解决上述问题，本专利技术公开了一种肠道病毒71型核酸扩增荧光 定量和液态芯片双检试剂盒，包括一对EV71基因组特异性引物A和A，，其中A和/或A，的5'端 标记有生物素；一对EV71基因组特异性引物B和B，，其中B和/或B，的5'端标 记有生物素；一种交联与引物A和A'扩增片段序列配对的探针F的荧光编码微 球C;一种交联与引物B和B'扩增片段序列配对的探针G的荧光编码微 球D;一对EV71基因组特异性保守序列引物E和E';一条5'端标记荧光基团和3'端标记BHQ的Taq-Man探针；QRT-PCR试剂；荧光物标记的亲和素。本专利技术中，定义"EV71基因组特异性引物"是指以GeneBank中已公 开的EV71核酸序列为模板，本领域技术人员通过公知的引物设计软件得 到针对EV71基因组特异性引物序列，相应的引物可以通过核酸合成仪制 备得到。本专利技术中所述引物A和A， 、 B禾nB， 、 E禾BE，的序列均不 相同。在一实施方式里，所述的荧光编码微球C为luminex公司的144微球。 在一实施方式里，所述的荧光编码微球D为luminex公司的146微球。 在一些实施方式里，所述荧光物标记的亲和素中荧光物选自异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、3价镧系螯合物如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)、铈(Ce3+)等中之一，其中优选藻红蛋白。 在一些实施方式里，所述的荧光基团是FAM， TET， VIC，或HEX。 在一实施方式里，所述的一对EV71基因组特异性保守序列引物E和 E'的核苷酸序列为5，-GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3，(SEQ ID NO:l) 和5，-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3， (SEQIDNO:2);所述标记荧光 基团的 T叫-Man 探针的核苷酸序列为 FAM画TCGCACAGCACAGCTGAGACCAC誦BHQ(SEQ ID NO:3)在一实施方式里，所述的EV71基因组特异性引物A和A，的核苷酸 序列为5，-GCGGGTAGTGTGTCGTAAC-3 ，(SEQ ID NO:4)和5， -GGTGGTCACAGACTTCAAGGTT-3， (SEQ ID NO:5);所述与引物A和 A'扩增片段序列配对的探针F的核苷酸序列为5 ' 画NH-TTTTTTGGATTGGCCATCCGGTGTGCA-3'(SEQ ID NO:6)。在一实施方式里，所述的EV71基因组特异性引物B和B，的核苷酸 序列为5，醫GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3，(SEQ ID NO:7)禾口 5，-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3， (SEQ ID NO:8);所述与引物B和 B'扩增片段序列配对的探针G的核苷酸序列为5 ' -NH-TTTTTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAC-3' (SEQ ID NO:9)。本专利技术的思路基于肠道病毒71型基因组的保守区结构，设计特异性引物及探针，通过荧光定量PCR与液态基因芯片进行双检诊断。荧光 定量PCR为阳性，定为阳性，无需再进行液态基因芯片检测。荧光定量 PCR为阴性，进行液态基因芯片检测。通过双检方法可以大大提高EV71 检出率。荧光定量PCR EV71检测技术方案(1) 引物与探针的设计针对EV71基因组特异性保守序列设计特 异性引物与探针。(2) EV71 QRT-PCR反应液的制备将各反应成分按一定浓度混合 在一起。(3) 病毒核酸检测取病毒RNA核酸加入QRT-PCR反应液及反应 酶进行荧光定量PCR反应。(4)结果判断根据扩增曲线Ct值，并与参照品比较，判断样品属性。液态芯片EV71检测技术方案(1) 引物与探针的设计设计两对EV71特异性引物及相应的杂交探针对两个区域进行PCR扩增和检测。(2) 探针与荧光编码微球的交联。(3) EV71RT-PCR反应液的制备将各反应成分按一定浓度混合在一起。(4) 病毒核酸检测通过PCR扩增，荧光编码微球探针与产物的杂交，最后进行液态基因芯片检测。(5) 结果判断，根据参照品检测数据计算Cutoff值，从而判断样品属性。另一方面，本专利技术还公开了一种肠道病毒71型检测方法，包括荧光 定量PCR与液态基因芯片两种方法对病毒核酸联合检测，荧光定量PCR 为阳性，定为阳性，无需再进行液态基因芯片检测；荧光定量PCR为阴性， 再进行液态基因芯片检测。两种方法联合作用可以极大地降低漏检率。本专利技术通过设计特异性扩增引物与探针(包括Taq-Man探针与荧光 编码微球探针)序列，高效的扩增反应与液芯检测体系及程序，最大程度 的实现了荧光定量PCR技术的高灵敏性，高特异性，定量精确性等特点， 操作简捷，单个反应从样品处理只需2-3 h。液态生物芯片检测不仅拥有 更为优异的特异性与灵敏度，更拥有常规检测技术不可能具有的特点高 通量， 一个体系内一次即可检测高达100个指标，同时结果稳定，重复性 好，操作简便。另外，荧光定量PCR虽然本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肠道病毒７１型核酸扩增荧光定量和液态芯片双检试剂盒，包括： 一对ＥＶ７１基因组特异性引物Ａ和Ａ’，其中Ａ和／或Ａ’的５’端标记有生物素； 一对ＥＶ７１基因组特异性引物Ｂ和Ｂ’，其中Ｂ和／或Ｂ’的５’端标记有生物素； 一种交联与引物Ａ和Ａ’扩增片段序列配对的探针Ｆ的荧光编码微球Ｃ； 一种交联与引物Ｂ和Ｂ’扩增片段序列配对的探针Ｇ的荧光编码微球Ｄ； 一对ＥＶ７１基因组特异性保守序列引物Ｅ和Ｅ’； 一条５’端标记荧光基团和３’端标记ＢＨＱ的Ｔａｑ－Ｍａｎ探针； ＱＲＴ－ＰＣＲ试剂； 荧光物标记的亲和素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱文斯，
申请(专利权)人：上海佑安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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