检测石蜡包埋肝组织乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ的试剂盒制造技术

石蜡包埋肝组织的乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ定量检测试剂盒，特征是对肝组织进行石蜡包埋，然后将从中提取的总ＤＮＡ分别加入ＨＢＶ滚环引物和跨缺口引物，进行滚环加跨缺口荧光定量扩增。本试剂盒不需要新鲜肝组织作为检测样本，检测特异性好，灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种乙型肝炎病毒cccDNA定量检测的方法，特别是用于微量石蜡包埋肝组织乙型肝炎病毒cccDNA定量检测的方法和检测试剂盒。
技术介绍
：乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)是HBV持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素。定量检测HBV cccDNA对于评价乙肝患者抗病毒治疗效果具有十分重要的意义，但目前在临床上尚未得到开展。有两个因素制约了HBV cccDNA检测的实际应用。一方面是样本来源的的问题：由于乙型肝炎病毒cccDNA主要存在于肝细胞核，需要用人新鲜肝组织作为检测样本，然而新鲜肝组织不容易得到。除非要求患者专为进行该项检测而接受创伤性的肝穿。且新鲜肝组织保存条件苛刻，无疑给科研和临床开展该项目检测产生阻碍。目前常规病理检测用甲醛固定石蜡包埋肝组织(FFPET)作为检测对象，可保存时间长，但现有的技术方法不能进行石蜡包埋肝组织cccDNA检测。目前国产试剂主要用于血清和外周血单个核细胞样本，但是由于cccDNA是否存在于血液尚有争议(由于HBV cccDNA主要存在于肝组织，血清中不存在或仅在肝细胞炎性坏死后有少量进入外周血，单独进行血清HBV cccDNA检测的意义十分有限)；而且血清和外周血保存时间短，因此血液并不是检测cccDNA的理想样本。文献EUR J Gastroenterol Hepatol.2010Feb 10.[Epub ahead of print]，Detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA in paraffin-embedded and cryo-preserved liver biopsies of chronic hepatitis B patients.报道了“定量检测石蜡包埋肝穿组织中乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)”。但该文献报道的石蜡包埋肝穿组织中DNA提取方法与本专利技术不同，且该方法定量cccDNA仅采用跨缺口PCR，没有采用PSAD酶消化和滚环扩增，不能保证检测的特异性和灵敏性。另外在技术方面：目前HBV cccDNA检测主要方法为荧光探针检测技术，其中之一是跨缺口实时荧光定量PCR技术，采用跨rcDNA缺口区引物扩增cccDNA。滚环扩增(rolling cycle amplification，RCA)是一种体外等温核酸扩增方法，其特点是只能扩增闭合环状DNA，不能有效去除PSAD酶未消化完全的非闭合环状DNA，所以仅用滚环扩增方法难以完成HBV cccDNA的定量检测。这些方法存在以下几个问题：1.检测的特异性和灵敏性不强HBV cccDNA主要存在于肝细胞核中。由于HBV cccDNA的含量通常远远低于HBV松驰环状DNA(rcDNA)，跨缺口实时荧光PCR方法和Invader方法难以保证检测的特异性和-->灵敏性。2.无法区分整合DNA和cccDNAHBV慢性感染特别是肝硬化患者肝组织中存在大量整合HBV DNA，即使采用目前先进的PSAD酶降解非闭合环状DNA，仍不能保证非闭合环状DNA被完全彻底消化，也不能有效区别cccDNA和整合HBV DNA。3.不能有效区分整合DNA、松驰环状DNA(rcDNA)和闭合环状DNA(cccDNA)。4、样本间的差异干扰数据分析，没有内参进行标准化。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种不需要新鲜肝组织作为检测样本的乙型肝炎病毒cccDNA定量检测方法和检测试剂盒，且灵敏度高、特异性强、简单方便。本专利技术提供的方法是，将石蜡包埋肝组织中提取的总DNA分别加入HBV滚环引物和跨缺口引物，进行滚环扩增加跨缺口荧光定量PCR；所述总DNA可以从乙肝患者病理检查剩余的微量石蜡包埋肝组织切片中提取。且需要量非常少，仅取4-6微米厚的切片2-3片便可完成检测(见实施例)。具体操作步骤是：(1)石蜡包埋肝组织；(2)提取肝组织总DNA；(3)设计、合成引物与探针；(4)滚环扩增加跨缺口荧光定量cccDNA；(5)加入内参照标准化，消除样本间的差异。所述石蜡包埋肝组织，包括以下步骤：1、固定；2、水洗；3、脱水；4、透明；5、浸蜡；6、包埋；7、切片。分述如下：1、固定：将肝组织固定于10％福尔马林，其目的在于保存组织内细胞的形态、结构及其组成，使其与生活时相似。2、水洗：将组织块用水冲洗。目的是洗去渗入组织中的固定液。3、脱水：将组织块用75％-100％乙醇脱水，乙醇浓度为每次更换新的脱水剂时从低浓度到高浓度。目的是把组织中的水分彻底脱除，有利于组织的透明和浸蜡，便于永久保存。4、透明：在二甲苯中两次透明。目的是使组织中的乙醇被透明剂所代替，以使石蜡能很顺利地进入组织中；还能增强组织的折光系数。5、浸蜡：将透明好的组织块用石蜡浸透。浸蜡目的是为下一步包埋做准备。6、包埋：将组织块包埋在石蜡中，待凝固冷冻，使其便于切片。7、切片。石蜡包埋肝组织的详细操作方法见实施例。所述跨缺口荧光定量扩增技术，优选为Taqman跨缺口荧光定量扩增。若在进行滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR方法之前，先在单管中进行不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(Plasmid safe ATP-dependent DNase，简称为PSAD)消化非闭合环状DNA，则检测效果更好。经实验证实，本方法不仅可应用新鲜肝穿组织，还可以应用微量的福尔马林固定石蜡包埋肝穿组织(formalin-fixed paraffin embedded，FFPE)进行检测(代表性结果见附图3)本方法可以完全排除rcDNA和整合HBV DNA的干扰。本专利技术扩增线性范围宽：相同-->PCR条件下，可扩增标准品HBV cccDNA浓度范围102-1010拷贝/毫升(图1)。本专利技术研发了可以利用微量石蜡包埋肝组织检测cccDNA的滚环扩增+跨缺口荧光定量PCR新技术，尤其是突破了以往对HBV cccDNA的检测在方法学上特异性、灵敏度不高，不能有效区分整合DNA、松驰环状DNA(rcDNA)和闭合环状DNA(cccDNA)的技术瓶颈。当血清中HBV DNA含量用现有技术方法无法检测到时，用本方法仍可检测到肝组织中HBV cccDNA，最低可检测0.1拷贝/肝细胞。特别是不需要新鲜肝组织作为检测样本，采用临床病理检查剩余的石蜡包埋肝组织，不需额外取样，患者容易接受。通过对100例慢性乙型肝炎和HBV感染相关肝硬化、肝癌患者的新鲜冰冻及石蜡包埋肝组织的检测，30例非乙型肝炎患者新鲜冰冻及石蜡包埋肝组织的检测，以及200余例HBV感染患者及健康人血清的检测，表明我们建立的检测方法具有良好的特异性、灵敏度和稳定性。本专利技术的有益效果是：1、不需要新鲜肝组织作为检测样本，采用临床病理检查剩余的石蜡包埋肝组织即可完成检测。解决了以往只能用新鲜肝组织检测造成HBV cccDNA检测用量大、样本来源困难的难题。2、灵敏度高检测cccDNA标准品灵敏度达到102拷贝/毫升。当乙肝患者血清中HBV DNA含量用现有技术方法无法检测到时，用本方法仍可检测到石蜡包埋肝组织中HBV cccDNA，最低可检测0.1拷贝/肝细胞。从附图2、图3可以看出，滚环扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
石蜡包埋肝组织的乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ定量检测方法，特征是先将肝组织进行石蜡包埋，然后将从中提取的总ＤＮＡ分别加入ＨＢＶ滚环引物和跨缺口引物，进行滚环加跨缺口荧光定量扩增。

【技术特征摘要】
1.石蜡包埋肝组织的乙型肝炎病毒cccDNA定量检测方法，特征是先将肝组织进行石蜡包埋，然后将从中提取的总DNA分别加入HBV滚环引物和跨缺口引物，进行滚环加跨缺口荧光定量扩增。2.权利要求1所述的方法，具体操作步骤是：(1)石蜡包埋肝组织；(2)提取肝组织总DNA；(3)设计、合成引物与探针；(4)滚环扩增加跨缺口荧光定量HBV cccDNA；(5)加入内参照标准化，消除样本间的差异。3.权利要求1或2所述的方法，所述石蜡包埋，包括以下步骤：1)固定；2)水洗；3)脱水；4)透明；5)浸蜡；6)包埋；7)切片。4.权利要求3所述的方法，所述石蜡包埋，包括以下步骤：1)固定：将肝组织固定于10％福尔马林；2)水洗：将组织块用水冲洗；3)脱水：将组织块用75％-10...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟彦伟，徐东平，韩佳琪，任晓强，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三〇二医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]