滚环扩增加跨缺口荧光定量ＰＣＲ检测乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ定量检测的方法，采用滚环扩增加跨缺口实时荧光ＰＣＲ技术检测ｃｃｃＤＮＡ的方法定量检测乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ，并以此方法开发了一种新型的检测试剂盒。本发明专利技术可同时提高检测反应特异性和灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种乙型肝炎病毒cccDNA定量检测的方法，特别是涉及采用滚环扩增加跨缺口荧光定量PCR技术定量检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的方法；本专利技术还涉及利用此方法研制的乙型肝炎病毒cccDNA检测试剂盒。
技术介绍
：乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，以下简称为HBV cccDNA)是乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的结构完整的、超螺旋双链DNA分子。目前HBV cccDNA检测主要方法为荧光探针检测技术，通过选择性扩增HBVcccDNA，使检测的灵敏度和实用性得到明显提高，根据对模板的扩增方法不同分为两类：一是跨缺口实时荧光定量PCR技术(PSAD酶降解非闭合环状DNA法，不降解质粒的ATP依赖的DNA酶Plasmid safe ATP-dependent DNase，简称为PSAD)，二是Invader技术，二者均可通过荧光标记探针进行HBV cccDNA的定量检测。PCR技术的基本原理是采用跨rcDNA缺口区引物扩增cccDNA，但为防止rcDNA在PCR退火过程中形成可被扩增的模板，需在扩增前用PSAD消化非闭合环状DNA或采用特殊设计的嵌合引物特异性扩增cccDNA。Invader法的基本原理是通过一条与模板完全互补的Invader探针和一条与模板部分互补的初级探针，后者与模板互补部分与前者的3’端紧邻；当探针与模板杂交后形成一个部分重叠的结构，进而初级探针上5’端与模板不互补的部分被酶切割产生被称作5’flap的核苷酸短链；在特定温度下，这一过程可以循环反复，所产生的5’flap按比例地将模板信号放大，并被检测5’flap的荧光标记探针捕获。上述方法存在以下几个问题：1、检测的特异性和灵敏度不强HBV cccDNA主要存在于肝细胞核中。由于HBV cccDNA的含量通常远远低于HBV松驰环状DNA(rcDNA)，跨缺口实时荧光PCR方法和Invader方法难以保证检测的特异性和灵敏度。2、Invader技术和跨缺口实时荧光定量PCR技术无法区分整合DNA和cccDNAHBV慢性感染特别是肝硬化患者肝组织中存在大量整合HBV DNA，即使采用目前先进的PSAD酶消化非闭合环状DNA，仍不能保证非闭合环状DNA被完全彻底消化，也不能有效区别cccDNA和整合HBV DNA。3、不能有效区分整合DNA、松驰环状DNA(rcDNA)和闭合环状DNA(cccDNA)。4、样本间的差异干扰数据分析，没有内参进行标准化。如北京索奥生物医药科技有限公司生产的“乙型肝炎病毒cccDNA检测试剂盒”，上海复星医药集团出品的“HBV cccDNA PCR荧光定量检测试剂盒”，均为直接PCR扩增，不-->进行PSAD酶消化和滚环扩增环节，而且无内参照，不能消除不同样本间的差异，特异性和灵敏度低。滚环扩增(rolling cycle amplification，RCA)是一种体外等温核酸扩增方法。原理是寡核苷酸引物与环状模板结合后，在特异的聚合酶的作用下循环扩增，滚环只有在单链闭合状态并有相应引物存在下才能同温滚动复制。2008年9月Margeridon Séverine等人首先报道运用RCA方法获得了乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)全基因序列(Margeridon S，Carroue′e-Durantel S，Chemin I，et al.Rolling circle amplification.a powerful tool for genetic and functional studies of complete hepatitis B virus genomes from low-level infections and for directly probing covalently closed circular DNA.Antimicrob Agents Chemother，2008，52(9)：3068)。2009年6月我们实验室也报道了应用RCA技术扩增我国慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA序列(任小强，……钟彦伟等，滚环扩增在乙型肝炎病毒cccDNA检测中的应用，2009，34(6)：675-678)。滚环扩增(RCA)的特点是只能扩增闭合环状DNA，不能有效去除PSAD酶未消化完全的非闭合环状DNA，所以仅用滚环扩增方法难以完成HBV cccDNA的定量检测。
技术实现思路
：本专利技术是提供一种新型灵敏度高、特异性强、且简单方便的乙型肝炎病毒cccDNA定量检测试剂盒，用于乙型肝炎患者肝组织HBV cccDNA定量检测。本专利技术克服了现有技术的缺点，研究出了采用滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR技术检测cccDNA的方法，并以此方法为基础开发了一种新型的检测试剂盒。本方法的主要特征是：从乙肝患者肝组织中提取总DNA，分别加入滚环引物和跨缺口引物，进行滚环加跨缺口荧光定量扩增。具体操作步骤是：(1)提取肝组织总DNA；(2)设计、合成引物与探针；(3)滚环扩增加跨缺口荧光定量cccDNA；(4)加入内参照标准化，消除样本间的差异。所述跨缺口荧光定量扩增技术，优选为Taqman跨缺口荧光定量扩增。若在进行滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR方法之前，先在单管中进行不降解质粒的ATP依赖的DNA酶(Plasmid safe ATP-dependent DNase，简称为PSAD)消化非闭合环状DNA，则检测效果更好。本方法可将肝穿组织作为检测样本。本专利技术研发了可以区别整合HBV DNA、HBV rcDNA和cccDNA的滚环扩增+跨缺口荧光定量PCR新技术，突破了以往所用方法灵敏度不高、特异性不强、不能有效区分整合DNA、松驰环状DNA(rcDNA)和闭合环状DNA(cccDNA)的技本瓶颈。当血清中HBVDNA含量用现有技术方法无法检测到时，用本方法仍可检测到肝组织中HBV cccDNA，最低可检测0.1拷贝/肝细胞。通过对140例慢性乙型肝炎和HBV感染相关肝硬化、肝癌患者的肝组织的检测，30例非乙型肝炎患者肝组织的检测，以及200余例HBV感染患者及健康人血清的检测，表明我们建立的检测方法具有良好的特异性、灵敏度和稳定性。本方法可以完全排除rcDNA和整合HBV DNA的干扰，对肝穿组织cccDNA进行检测。-->本专利技术扩增线性范围宽：相同PCR条件下，扩增标准品DNA浓度范围102-1010拷贝/毫升(图1)。与现有技术的检测产品相比，本专利技术具有较好的特异性、灵敏度和稳定性：1、与北京索奥生物医药科技有限公司“乙型肝炎病毒cccDNA扩增检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，直接PCR扩增”相比较，增加了PSAD酶消化和滚环扩增环节，增加了内参照以消除不同样本间的差异，特异性和灵敏度大大提高。当血清中HBV DNA含量用现有技术方法无法检测到时，用本方法仍可检测到肝组织中HBV cccDNA，最低本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙型肝炎病毒ｃｃｃＤＮＡ定量检测的方法，特征是将肝组织提取的总ＤＮＡ分别加入滚环引物和跨缺口引物后，进行滚环加跨缺口荧光定量扩增。

【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒cccDNA定量检测的方法，特征是将肝组织提取的总DNA分别加入滚环引物和跨缺口引物后，进行滚环加跨缺口荧光定量扩增。2.权利要求1所述的方法，操作步骤是：(1)提取肝组织总DNA；(2)设计、合成引物与探针；(3)滚环扩增；(4)跨缺口荧光定量cccDNA；(5)加入内参照标准化，消除样本间的差异。3.权利要求1或2所述的方法，所述跨缺口荧光定量扩增技术，是Taqm...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟彦伟，徐东平，韩佳琪，苏何玲，任晓强，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三〇二医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]