肠道病毒７１型核酸扩增液态芯片检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种肠道病毒７１型的检测试剂盒。本发明专利技术公开了一种肠道病毒７１型核酸扩增液态芯片检测试剂盒，包括：一对５’端标记有生物素ＥＶ７１特异性引物Ａ和Ａ’；一对５’端标记有生物素ＥＶ７１特异性引物Ｂ和Ｂ’；一种交联与引物Ａ和Ａ’扩增片段序列配对的探针Ｅ的荧光编码微球Ｃ；一种交联与引物Ｂ和Ｂ’扩增片段序列配对的探针Ｆ的荧光编码微球Ｄ；ＱＲＴ－ＰＣＲ试剂和荧光物标记的亲和素。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种肠道病毒71型的检测试剂
技术介绍
肠道病毒71型(enterovirus71， EV71)是小RNA病毒科 (Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员。EV71感染主要引起患 者手足口病(HFMD)，并且是该病的主要病原体。另外，EV71还可引起无 菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种神经系统相关疾病， 并可暴发流行，导致死亡，严重危害人类健康。为了在EV71相关疾病暴发时能够迅速查明病因，从而及时采取正确、 有效的控制措施，亟需针对EV71的准确、快速、高灵敏度、高特异性、 高通量的新型诊断手段。肠道病毒感染具有"一因多病， 一病多因"的特 点，仅根据临床症状不易做出正确的诊断。例如，引发手足口病的肠道病 毒就有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、 4、 5、 9、 10型，B组的2、 5型，以及肠道病毒71型均为手足口病较常见的病原体，其中以肠道病 毒71型和柯萨奇病毒A16型(Coxsakie A16，简称CoxA16)最为常见。肠 道病毒的传统检测方法是病毒分离、血清中和试验和分子生物学诊断技 术。病毒分离操作复杂、耗时长、费用高、分离率低。免疫学方法虽然比 分离培养法更加简便、快速，但是整个检测时间仍需1周左右的时间。病 人感染病毒后，血清中产生特异性抗体需要一段时间。另外，EV71感染 后只有2 10天(平均3 5天)的潜伏期，而传染力始于发病的前几天， 所以免疫学方法敏感度较低，尤其不适合早期诊断。毒株抗原变异、抗原 抗体交叉反应、患者个体差异等均在较大程度上影响了该法的准确性与特异性。近年来，聚合酶链式反应(PCR)技术广泛应用于病毒特异性基因的检测，尽管它也具有灵敏、特异、快速的优点，但结果判定需要电泳，且 反应产物容易产生污染而导致假阳性。由此可见，目前常用的肠道病毒71型检测手段均存在较大的不足，不 能满足疾病暴发时对大量临床样本，尤其是早期样本准确、快速诊断的要 求。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是现有肠道病毒71型检测手段均存在较 大的不足的问题为了解决上述问题，本专利技术公开了一种肠道病毒71型核酸扩增液态芯 片检测试剂盒，包括一对EV71基因组特异性引物A和A，，其中A禾口/或A，的5'端标 记有生物素；一对EV71基因组特异性引物B和B，，其中B和/或B，的5'端标 记有生物素；一种交联与引物A和A'扩增片段序列配对的探针E的荧光编码微球C;一种交联与引物B和B'扩增片段序列配对的探针F的荧光编码微球D;QRT-PCR试剂；荧光物标记的亲和素。本专利技术中，定义"EV71基因组特异性引物"是指以GeneBank中已公开 的EV71核酸序列为模板，本领域技术人员通过公知的引物设计软件得到 针对EV71基因组特异性引物序列，相应的引物可以通过核酸合成仪制备 得到。本专利技术中所述引物A和A' 、 B和B，的序列均不相同。在一实施方式里，所述的荧光编码微球C为luminex公司的144微球。 在一实施方式里，所述的荧光编码微球D为luminex公司的146微球。在一些实施方式里，所述荧光物标记的亲和素中荧光物选自异硫氰酸 荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、藻红蛋白、3价镧系螯合物如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)、铈(Ce3+)等中之一，其中优选藻红蛋白。 在一些实施方式里，所述的荧光基团是FAM， TET， VIC，或HEX。 在一实施方式里，所述的EV71特异性引物A和A'的核苷酸序列为5' -GCGGGTAGTGTGTCGTAAC-3 ， (SEQ ID NO:4)和5， -GGTGGTCACAGACTTCAAGGTT-3 ， (SEQ ID NO:5);所述与引物A和 A'扩增片段序列配对的探针E的核苷酸序列为5' -NH-TTTTTTGGATTGGCCATCCGGTGTGCA-3'(SEQ ID NO:6)。在一实施方式里，所述的EV71特异性引物B和B，的核苷酸序列为5' -GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3' (SEQ ID NO:7)禾卩5'-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3， (SEQ ID NO:8);所述与引物B和 B'扩增片段序列配对的探针F的核苷酸序列为5' -NH-TTTTTTCAGCAGAGCGGGATTAGTTGGAC-3' (SEQ ID NO:9)。 核酸扩增液态芯片EV71检测技术步骤(1) 引物与探针的设计设计两对EV71特异性引物及相应的杂交探 针对两个区域进行PCR扩增和检测。(2) 探针与荧光编码微球的交联。(3) EV71 RT-PCR反应液的制备将各反应成分按一定浓度混合在一起。(4) 病毒核酸检测通过PCR扩增，荧光编码微球探针与产物的杂 交，最后进行液态基因芯片检测。(5) 结果判断，根据参照品检测数据计算Cutoff值，从而判断样品属性。本专利技术所公开的液态生物芯片检测不仅拥有更为优异的特异性与灵敏度，更拥有常规检测技术不可能具有的特点高通量，同时结果稳定，重复性好，操作简便。独特的扩增位点选择，尤其是液态芯片的双区域检测，5可以显著地降低因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)及新亚型病毒株出现而导致的检测假阴性，保证了检测结果的准确性，最 终符合当前肠道病毒临床检验的快速、灵敏、简便、准确、高通量的要求。具体实施方式以下结合具体实施例，进一歩阐明本专利技术。应理解，这些实施例仅用 于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件 的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和 百分比基于重量，除非特别说明。下面用实施例来进一步说明本专利技术，但本专利技术并不受其限制。 (一)荧光定量PCREV71检测试剂对临床样本的检测(液态芯片检 测同步进行，在此分开描述)(1) 引物与探针的设计针对EV71基因组特异性保守序列设计一对 引物与一条5'端标记荧光基团和3'端标记BHQ的Taq-Man探针，探 针标记FAM基团。探针序列5 ， -TCGCACAGCACAGCTGAGACCAC-3 ， (SEQIDNO:3)。上游引物5'画GATTGAGACACGCTGTGTTCT-3， (SEQ ID NO:l);下游引物5，-GCCTTCAAGAGGGAGGTCTATC-3， (SEQ ID NO:2);(2) EV71 QRT-PCR反应液的制备将各反应成分混合在一起，成分 及浓度(20pL体系)为2x反应Mixl0pL，上游引物终浓度0.4 ^M， 下游引物终浓度0.2 (aM，探针终浓度0.4pM。(3) 参照品的制备以肠道病毒71型的核酸为模板，通过RT-PCR 方法获得PCR产物后，稀释成特定浓度制成强阳性对照和临界阳性对照。 阴性对照以采用"金标"确认为EV71阴性结果的粪便标本制备而成。(4) 病毒核酸抽提病毒核酸抽提由深圳市疾病预防控制中心(CDC) 提供(利用Promega病毒核酸磁珠抽提试剂盒在Beckman Biomek 3000 核酸自动提取仪上完成)，检测实验在该机构微生物检测中心完成。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肠道病毒７１型核酸扩增液态芯片检测试剂盒，包括：　　一对ＥＶ７１基因组特异性引物Ａ和Ａ’，其中Ａ和／或Ａ’的５’端标记有生物素；　　一对ＥＶ７１基因组特异性引物Ｂ和Ｂ’，其中Ｂ和／或Ｂ’的５’端标记有生物素；　　一种交联与引物Ａ和Ａ’扩增片段序列配对的探针Ｅ的荧光编码微球Ｃ；　　一种交联与引物Ｂ和Ｂ’扩增片段序列配对的探针Ｆ的荧光编码微球Ｄ；　　ＱＲＴ－ＰＣＲ试剂；　　荧光物标记的亲和素。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文斯，
申请(专利权)人：上海佑安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]