本发明专利技术公开了一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量ＰＣＲ分型检测方法。它包括一个以荧光定量ＰＣＲ技术为基础的四重ＰＣＲ反应体系，包含针对４种人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）基因型的正、反向引物和ＡｌｌＧｌｏ荧光探针，在适合的ＰＣＲ条件下可在一个反应管中同时检测最多包括ＨＰＶ－６、－１１、－１６、－１８的ＤＮＡ载量，包括特异性引物及荧光探针的设计、标准分子的构建、标准曲线制备及临床标本检测。本发明专利技术可以简便快速地在一个反应管中同时、快速地检测临床常见四型ＨＰＶ感染，实现了单管ＰＣＲ同时分型检测四型ＨＰＶ，且能够定量检测，操作简单快速，灵敏度高，特异性、重复性好，结果准确可靠，对尖锐湿疣及常见型ＨＰＶ致妇女宫颈癌变的早期防治、阻断传染源、减少ＨＰＶ感染、监测临床疗效均有很大的临床价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，具体地说，本专利技术涉及应用四重实时荧光定量PCR技术在一个PCR反应管中快速、平行地同时检测四型人乳头瘤病毒(HPV-6，-ll，-16，-18)的方法。
技术介绍
人乳头瘤病毒(H咖anp即illomavirus， HPV)是一种双链DNA病毒，通过人体接触传播，在多种皮肤黏膜的良、恶性增生和生殖器感染中较为常见，迄今为止，全世界已发现逾120多种HPV基因型，各型HPV与其生物学行为存在着高度相关性，不同基因型的HPV具有不同的致病危险性， 一般分为高危型HPV和低危型HPV。 高危型HPV感染可以引起女性宫颈及其他生殖器癌变，而宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，全球每年约有50万新增病人，发病率在女性肿瘤中占第二位，但其死亡率则占第一位，95%以上的宫颈癌与人乳头瘤病毒感染有关。低危型HPV感染可导致宫颈上皮细胞轻度病变、产生生殖器疣、皮肤、经常性喉或呼吸道乳头状瘤等。在引起人类生殖器、肛门等部位感染的诸多基因型HPV中，最常见的只有四种基因型别HPV(HPV-6、 -11、 -16、 -18)。 一些研究表明，大约70%的宫颈上皮细胞发育不良和宫颈癌是有HPV-16， -18感染引起的，其中HPV-16约占55%， HPV-18约占10-15% ，另外，相当一部分的阴道、外阴、肛门、阴茎等部位癌变与HPV-16、 -IS持续感染密切相关。在男女外生殖器病变中，90X以上的外生殖器疣是由HPV-6、， -11感染引起的，另外肛门疣也主要是HPV-6 ， _ 11感染造成的。在中国，约有90 %的生殖器疣肛门疣由HPV-6 、-ll型引起，中国妇女宫颈癌组织中HPV感染率大于95%，其中HPV-16、-18型占90%以上。 鉴于HPV-6、 -11、 -16、 -18的高感染率及其危害性，预防HPV感染尤其是HPV-6、 -11、 -16、 -18感染可以有效控制宫颈癌和尖锐湿疣等的发生，因此，全球很多公司都在研制HPV疫苗，Merck公司已经研制出了针对HPV-6、 -11、 -16、 _18型的四价疫苗，并在很多国家得以应用，然而，在应用四价疫苗 前，必须要了解被接种者是否感染了 HPV，尤其是HPV-6、 -11、 -16、 -18，只有在被接种者未感染HPV-6、 -11、 -16、 -18情况下，才可以接种HPV四价疫苗，所以首先必须为接种者检测HPV-6、 -11、16、 -18，因此，同时快速准确的HPV-6、-ll、16、-18分型检测意义重大。 HPV感染的潜伏期长，不易在体外培养，亚临床感染常见，加之血清学试验又不能区别近期和远期感染，因此，对HPV感染的分型诊断，目前主要依赖分子生物学手段对病毒DNA进行检测。目前常用的方法有PCR、基因芯片技术、DNA测序和第二代杂交捕获法，其中杂交信号放大法的杂交捕获II代(HC-II)和靶DNA扩增法的PCR方法是目前应用最多的HPV-DNA检测方法。 但是，这些方法大多对操作人员要求高，试剂昂贵，同时所需临床标本量大，需对临床标本多次扩增及多次分离分析，技术复杂，无法在临床检测中快速高通量地检出患者感染的HPV病毒类型及病毒载量。目前第二代杂交捕获法(HC-II)是惟一通过FDA批准的可在临床使用的一种检测HPV-DNA的技术，但仍然存在不能分型和定量的缺点。 在PCR基础上发展起来的多重实时荧光PCR技术同时检测多种或型病毒也有应用。但是，目前报道的荧光定量PCR检测HPV要么通量低，要么技术复杂、试剂昂贵、要么未实现四型HPV单管同时定量检测，难以满足临床上同时检测多个亚型的需要。但是，由于荧光定量PCR方法由于成本低、方便快速、操作简单、可以定量等诸多优点，该方法值得优化提高从而能够在临床上广泛应用。 荧光定量PCR技术发展日新月异，美国AlleLogic Biosciences公司推出了最新一代荧光定量探针-AllGlo探针，它拥有普通TaqMan、TaqMan-MGB及Molecular Beacon探针所有优点。本研究通过检测AllGlo特异性探针的荧光增量得知检测结果，能在一个PCR反应中同时检测四型HPV，灵敏度、特异性和重复性都达到了 95%。与HC-II方法相比，多重实时荧光PCR方法具有一下优势灵敏度高，线性范围广，本研究所建立的多重实时荧光PCR方法灵敏度可以达到10Copies/Test，最高可达109Copies/Test。 本项研究采用AllGlo探针技术，设计了四对特异引物和相应的探针，应用四重荧光定量PCR技术同时检测四型HPV，并对该技术反应条件进行了优化，建立了一种基于AllGlo探针技术的单管四重荧光定量PCR同时检测四型HPV的方法，适合于尖锐湿疣的快速早期预防和诊治，以及宫颈癌危险因素的评估，为生殖系统常见HPV感染的病程监测和疗效判断提供指导，应用前景广阔。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法。 人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法包括如下步骤 (1)引物设计在基因库中检索获得四型人乳头瘤病毒，即HPV-6、-ll、-16、-18特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定HPV-6、-ll、-16、-18亚型的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物； (2)荧光探针设计根据步骤(1)中的四型HPV的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针； (3)标准分子的构建根据步骤(1)确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有HPV-6、 -11、 -16、 -18高度保守序列区的标准质粒分子； (4)四重荧光PCR反应液组成使用步骤(1)中的引物和步骤(2)中的探针及2XqPCR Mix定量PCR试剂组成四重荧光PCR反应液； (5)四重荧光PCR反应的优化和建立通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系； (6)标准曲线制备使用步骤(5)中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有四型HPV目的扩增片段的重组质粒连续IO倍倍比稀释，加入到荧光定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，进行结果分析，制备标准曲线； (7)临床标本检测用已知HPV基因型别和病毒载量的临床标本病毒DNA提取液作为模板，进一步用步骤(5)和(6)的方法和条件进行四重荧光定量PCR扩增。 所述的特异性的保守基因，指的是HPV-6的衣壳蛋白基因，HPV-11的衣壳蛋白基因，HPV-16的E6蛋白基因和HPV-18的LI基因。 所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种亚型病毒基因所特有的一 段基因序列。 所述的特异性荧光定量PCR引物，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型 HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补。 所述的特异性荧光定量PCR荧光探针，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与 四型HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补，所有探针的5'端和3'端均本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量ＰＣＲ分型检测方法，其特征在于，包括如下步骤： （１）引物设计：在基因库中检索获得四型人乳头瘤病毒，即ＨＰＶ－６、－１１、－１６、－１８特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定ＨＰＶ－６、－１１、－１６、－１８亚型的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物； （２）荧光探针设计：根据步骤（１）中的四型ＨＰＶ的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针； （３）标准分子的构建：根据步骤（１）确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有ＨＰＶ－６、－１１、－１６、－１８高度保守序列区的标准质粒分子； （４）四重荧光ＰＣＲ反应液组成：使用步骤（１）中的引物和步骤（２）中的探针及２×ｑＰＣＲ Ｍｉｘ定量ＰＣＲ试剂组成四重荧光ＰＣＲ反应液； （５）四重荧光ＰＣＲ反应的优化和建立：通过１００－４００ｎＭ范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量ＰＣＲ反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的ＰＣＲ反应体系； （６）标准曲线制备：使用步骤（５）中的四重荧光ＰＣＲ反应体系，将已知拷贝数的含有四型ＨＰＶ目的扩增片段的重组质粒连续１０倍倍比稀释，加入到荧光定量ＰＣＲ主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）和基线（Ｂａｓｅｌｉｎｅ），进行结果分析，制备标准曲线； （７）临床标本检测：用已知ＨＰＶ基因型别和病毒载量的临床标本病毒ＤＮＡ提取液作为模板，进一步用步骤（５）和（６）的方法和条件进行四重荧光定量ＰＣＲ扩增。...
【技术特征摘要】
一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法，其特征在于，包括如下步骤(1)引物设计在基因库中检索获得四型人乳头瘤病毒，即HPV-6、-11、-16、-18特异性的保守基因，通过网上序列比对，确定HPV-6、-11、-16、-18亚型的高度保守序列区，作为待检靶基因特异性核酸序列设计特异引物；(2)荧光探针设计根据步骤(1)中的四型HPV的待检靶基因特异性核酸序列设计荧光探针；(3)标准分子的构建根据步骤(1)确定的特异引物，利用基因克隆技术构建四种分别含有HPV-6、-11、-16、-18高度保守序列区的标准质粒分子；(4)四重荧光PCR反应液组成使用步骤(1)中的引物和步骤(2)中的探针及2×qPCR Mix定量PCR试剂组成四重荧光PCR反应液；(5)四重荧光PCR反应的优化和建立通过100-400nM范围内各个浓度的引物和探针的组合，组成不同的四重荧光定量PCR反应体系，根据反应效率和曲线确定最终的PCR反应体系；(6)标准曲线制备使用步骤(5)中的四重荧光PCR反应体系，将已知拷贝数的含有四型HPV目的扩增片段的重组质粒连续10倍倍比稀释，加入到荧光定量PCR主反应液中，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，进行结果分析，制备标准曲线；(7)临床标本检测用已知HPV基因型别和病毒载量的临床标本病毒DNA提取液作为模板，进一步用步骤(5)和(6)的方法和条件进行四重荧光定量PCR扩增。2. 根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法， 其特征是，所述的特异性的保守基因，指的是HPV-6的衣壳蛋白基因，HPV-ll的衣壳蛋白基 因，HPV-16的E6蛋白基因和HPV-18的LI基因。3. 根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法， 其特征是，所述的待检靶基因特异性核酸序列，指的是针对每一种亚型病毒基因所特有的 一段基因序列。4. 根据权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒常见型四重荧光定量PCR分型检测方法， 其特征是，所述的特异性荧光定量PCR引物，指的是长度为20±3Nt的寡核苷酸链，与四型 HPV待检靶基因特异性核酸序列完全相同或互补。5. 根据权利要求1所述的一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：李兰娟，余道军，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。