一种利用核苷酸变化进行辐射农产品和食品检测的方法，属于食品卫生领域。具体是通过电泳的方法将细胞中断裂的ＤＮＡ泳出后观测其形态或测量尾长进行判断其是否经过辐射处理的方法。具体包括：细胞的分离、毛玻璃的处理、细胞的包埋、细胞的裂解、核苷酸的分离、显微荧光检测以及结果判断。本方法快速、简便，适合应用于大量样品的初筛检测，具有假阳性率低的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及辐射处理农产品和食品的检测方法，属于食品安全领域。
技术介绍
辐射处理技术作为一种食品保鲜技术已被全世界广泛采用，目前已有49个国家 至少核准了一类或一种辐射食品，35个国家已将此技术用于商业用途。食品辐射技术是运 用X射线、y射线或电子高速射线辐射食品，使食品中产生物理或化学反应，抑制或破坏其 新陈代谢和生长发育，甚至使细胞组织死亡，从而达到消毒灭菌、延长食品储藏销售时间、 减少损失的目的。虽然有越来越多的国家和消费者对辐射食品持认可态度，但是仍有一些 国家拒绝辐射食品，这些国家对进口辐射食品的限制甚严。因此为了达到国际贸易的相互 监督、检查，以利于严格管理和有效控制，辐射食品检测方法的研究也在不断加强。目前热释光法、ESR法以及化学法等一再国际贸易中被使用。由于这些方法均需 要使用昂贵的仪器，方法复杂、对操作人员要求也比较高，因此需要开发适合大量样品检测 的快速初筛检测方法。通过检测核苷酸变化的方法能够满足快速检测辐射食品的要求。最简单的检测 DNA的方法是过滤法。Flegeau等人用过滤法研究了冷冻的挪威龙虾肉中DNA分子大小的 变化，他们用2 ym孔径的滤器将DNA截留在滤器上，用显微荧光测定法测量截留的DNA的 量，他们发现，用3kGy计量辐射的龙虾肉保留的DNA量为0. 21 u g，比未辐射中的2. 32 y g 少得多。
技术实现思路
本专利技术针对食品安全中辐射食品检测种类繁多，检测通量要求高的特点，为解决 当前辐射食品检测中存在的价格昂贵、操作费时、检测通量低等缺陷，提供一种利用核苷酸 变化检测辐射食品的方法，具体来讲是通过检测辐射食品中核苷酸的变化来判断该食品是 否是经过辐射处理的食品的方法。DNA片段可由多种物理或化学方法处理得到，如离子辐射。将含有DNA的食品进行 离子辐射处理，则DNA的一条单链或者双链断裂而产生不同的DNA片段。这些片段可用单 细胞或者单细胞核凝胶电泳来检测。将样品用琼脂糖固定在显微镜载玻片上后，用去垢剂 裂解细胞以破坏细胞膜，然后在设定的电压下进行电泳。各DNA片段从细胞内向阳极方向 延伸或迁移，就如同向着阳极方向形成一条尾巴。由于细胞核中的超螺旋DNA的解体，使得 单链裂解对电泳图形形状也产生一定的影响。受到辐射的细胞其DNA(更多片段)从细胞 核到阳极的图形比未受到辐射的细胞更长一些。未受到辐射的细胞其图形近似于圆形或只 有很短的尾巴。利用核苷酸变化检测辐射农产品和畜禽肉的方法包括细胞的分离、毛玻璃的处 理、细胞的包埋、细胞的裂解、核苷酸的分离以及显微荧光检测。本专利技术是通过以下技术方案实现的1.细胞的分离对于鸡肉、猪肝样品等畜肉、禽肉或水产品样品可用解剖刀将切 成极薄的薄片，取lg样品转移至盛有2mL冰冷Hanks溶液的小烧杯中。用剪刀将小薄片剪 碎。对于胡椒、辣椒等植物样品可通过质量浓度为0. 25%胰酶、质量浓度为0. 的I型胶 原酶(Sigma) 1 1混合消化液消化20min，血清中和。悬浮液通过孔径大小200 u m的筛布 进行过滤。滤液放置于冰上，用Hanks液调整细胞浓度107-108/mL置冰浴中待用。2.铺胶将将lOOiiL细胞悬浮液与约lmL低熔点凝胶溶液(质量分数为 0.625%)混合。将载玻片置冰上5分钟，取100 yL混合物转移至已预涂层的载玻片上，用 解剖刀尖将盖玻片移至一侧，轻轻盖在琼脂糖上。确保凝胶均勻、无气泡。凝胶凝固后将盖 玻片揭掉。可以使用相同的凝胶液同时制备几块载玻片。3.裂解细胞将固定凝胶之后的载玻片完全浸入裂解缓冲液(2.5mol/L NaCl、 100mMNa2EDTA、质量分数为 0. N-月桂肌氨酸钠、10mMTris_HCl、0. 1% Triton X-100 和 体积分数为10%DMS0)中，室温下，浸泡1.5-2小时。不要碰琼脂糖层。裂解细胞后，将载 玻片浸入电泳缓冲液中5分钟。4.电泳将载玻片一个挨一个放在水平电泳槽中，避免留有空间，并使其磨砂面 正对阴极。加入新配置电泳缓冲液(1M Tris-HCl pH7. 2)至高出载玻片2_4mm(不要让载 玻片发生漂移)。室温，2V/cm(电压/电极间距离)电泳20分钟。小心取出载玻片，在水 中浸泡5分钟，无水乙醇脱水10分钟。5.染色将载玻片浸入溴化乙锭染液(2mg/L)中3_5分钟。浸泡在水中1_2分钟 清洗载玻片。在用荧光显微镜观察前，准备好盖玻片盖在载玻片的湿面上，沾掉多余水分。 立即观察，因干燥后会影响细胞观察效果。6.检测溴化乙锭和GELREAD染色的片子，荧光显微镜选择510nm-590nm(绿色激 发光)的滤波片观察。镜下DNA发红光。丫啶橙染料染色后DNA发并拍照。用图像分析系 统还可能对图形形式作客观的评价。计算慧星的长度或面积或拖尾或慧星头部或尾部其他 形式的DNA内含，还可能得出更多的信息。7.结果判断从拍到的照片中图形的长度可以对食品辐射情况进行判断。如果图 片中图形近似于圆形或只有很短的尾巴，则样品没有被辐射过；如果图形拖尾严重，则样品 曾经被辐射；如果图片中只有零星的片断但不是有规则的形状，则样品可能接受过超剂量 的辐射。用图像分析系统计算图形的长度、面积等数据，对这些数据取平均值，可以得出在 一定的辐射剂量下图形的平均长度、面积等数据。将这些数据与辐射剂量进行线性回归 (即以尾长为纵坐标，辐射剂量为横坐标，做线性回归)，可以根据样本的数据推测出其接 受辐射的剂量。例如经0kGy、lkGy、3kGy、5kGy和7kGy辐射的鸡肉细胞平均尾长和尾相分 别为 L01iim、2. 17iim、2. 86iim、3. 56 ii m 禾口 4. 12 ii m 以及 0. 37,0. 76,1. 07,1. 62 和 2. 04。 经统计学分析，辐射与未辐射鸡肉细胞电泳图尾长与尾相存在显著性差异，并存在一定的 剂量反应关系。应当理解的是，根据其检测原理，只要是能够通过剪碎或者酶消化后能够获得细 胞的样品来说，该方法均适用。因此该方法能够检测辐射处理的农产品如黑胡椒、辣椒、白 胡椒、大蒜、丁香、桂皮、芥末、小豆蔻、姜、麝香草、罗勒、牛至、水稻、小麦和畜禽肉如猪肉、 牛肉、羊肉、马肉、驴肉、狗肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、鸽肉、鹌鹑肉、火鸡肉或鸵鸟肉。本专利技术的第二个目的是提供一种利用核苷酸变化检测辐射食品的试剂盒，包括预涂层载玻片用一薄层琼脂糖对载玻片进行预涂层，以提高其与琼脂糖凝胶的 粘附性。预涂层前先将载玻片用甲醇浸泡过夜，除去上面的脂肪，之后风干。滴一滴(约 50 UL)加热的涂层琼脂糖溶液(质量分数为0.625%)于干净无尘的载玻片上，再加一片 载玻片交叉放在第一块载玻片上，风干，约30分钟。预涂层过程也可通过浸泡，用纸擦干载 玻片的一面来进行。涂好的载玻片可在无尘条件下保存几周时间。配制好的低熔点胶质量分数为0. 625%的低熔点胶。细胞裂解液配置细胞裂解A液(2. 5mol/LNaCl、100mM Na2EDTA、质量分数为 0. N-月桂肌氨酸钠和lOmMTris-HCl)。在每次使用前往细胞裂解A液中添加Triton X-100和DMS0，体积分数分别为0. 1 %和10%。电泳液1M Tris本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用核苷酸变化检测辐照农产品和畜肉的试剂盒，包括：（１）预涂层载玻片（２）配制好的低熔点胶：质量分数为０．６２５％的低熔点胶。（３）细胞裂解Ａ液：２．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、１００ｍＭＮａ↓［２］ＥＤＴＡ、质量分数为０．１％Ｎ－月桂肌氨酸钠和１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（４）电泳液：１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ７．２（５）染色液：２ｍｇ／Ｌ溴化乙锭染液、丫啶橙染料（将丫啶橙染料溶于含１％ＴｒｉｔｉｏｎＸ－１００的ＰＢＳ中，终浓度为６μｇ／ｍｌ，含Ｒｎａｓｅ１００μｇ／ｍｌ）或ＧＥＬＲＥＡＤ。
【技术特征摘要】
一种利用核苷酸变化检测辐照农产品和畜肉的试剂盒，包括(1)预涂层载玻片(2)配制好的低熔点胶质量分数为0.625％的低熔点胶。(3)细胞裂解A液2.5mol/L NaCl、100mM Na2EDTA、质量分数为0.1％N-月桂肌氨酸钠和10mMTris-HCl(4)电泳液1M Tris-HCl pH7.2(5)染色液2mg/L溴化乙锭染液、丫啶橙染料(将丫啶橙染料溶于含1％TritionX-100的PBS中，终浓度为6μg/ml，含Rnase100μg/ml)或GELREAD。2.权利要求1所述的试剂盒，其中预涂层载玻片可以是直接滴一滴琼脂糖溶液后加盖 另一块载玻片也可以是浸泡后擦干光面。3.权利要求1所述的试剂盒，其中电泳液可以是固态也可以是稀释后即可使用的母液。4.权利要求1至3种任一项所述的试剂盒用于辐射农产品和食品的方法，其中步骤包括1)直接剪碎或者酶消化中和后，将制备的悬浮液通过孔径大小200ym的筛布进行过 滤，滤液在冰上放置；2)将100u L细胞悬浮液与约lmL低熔点凝胶溶液(质量分数为0. 625% )混合。将 载玻片置冰上5分钟，取100 u L混合物转移至已预涂层的载玻片上，用解剖刀尖将盖玻片 移至一侧，轻轻盖在琼脂糖上。凝胶凝固后将盖玻片揭掉。3)往细胞裂解A液中添加TritonX-100和DMS0，体积分数分别为0. 和10%，混勻 后将玻片浸入。室温下，浸泡1.5-2小时。4)将载玻片一个挨一个放在水平电泳槽中，避免留有空间，并使其磨砂面正对阴极。 加入新配置电泳缓冲液(1M Tris-HCl pH7. 2)至高出载玻片2_4...
【专利技术属性】
技术研发人员：宓捷波，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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