采用反迁移高亲和性嵌入染料通过电泳分离和检测核酸制造技术

本发明专利技术提供了新的高分辨率分离和高灵敏度检测核酸的电泳方法。所述方法包括在电泳系统中采用高分辨率缓冲液和反迁移高亲和性嵌入染料以实现优良的分离和检测核酸。本发明专利技术还提供了通过电泳从样品中分离和检测核酸的试剂盒。所述试剂盒包括含高分辨率嵌入染料的凝胶缓冲液，所述嵌入染料的分辨率在２７１ｂｐ和２８２ｂｐφＸ１７４　Ｈａｅ　Ⅲ核酸片段之间至少为２．０，并且包括高亲和性嵌入染料，其具有正电荷以及ＤＮＡ亲和常数至少为１０↑［６］Ｍ↑［－１］。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术总体上涉及通过电泳分离和检测核酸。具体而言，本专利技术涉及采用反迁移嵌入染料进行的电泳。
技术介绍
从液体生物样品中分离和检测脱氧核糖核酸(DNA)的各种各样的方法在本领域是公知的。其中一种技术为电泳，包括当带电物质溶解或悬浮于有电流通过的电解液中时，其发生迁移。已知电泳的各种常规形式，包括自由区带电泳，凝胶电泳，等电聚焦，等速电泳，和毛细管电泳。按照惯例，核酸的分离和识别已通过凝胶电泳在诸如琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶的聚合物凝胶上完成。聚合物凝胶的制备类型和大小多种多样，而且孔隙度也是千变万化，因此聚合物凝胶具有广泛用途。然而，由于时间上缺乏稳定性，聚合方法的难再现性，介质的易碎性以及分离后的检测等缺陷，凝胶电泳通常不适于大规模和高速应用方面(H,T. Chang禾口 E.S. Yeung, J. Chromatogr. B (1995) 669, 113)。毛细管电泳(CE)在电泳分析核酸中代表了重要改进。例如，因为CE是在直径非常小的管(通常50-100 um)中进行的，导致局部焦耳热减少，因此可以施加比常规电泳系统大10-100倍的电场。这使电泳速度，分辨率和再现性都得以提高。此外，CE还提供了在柱检测途径，包括紫外(UV)分光光度计，电流测定，电导测定，激光诱导荧光检测(LIF)或热光学检测。进一步，由于CE提供了方便的在线注射，检测和实时数据分析，其还特别适用于自动化。由于注射到典型CE分析中的样品量较小，因此CE的实际应用高度依赖于灵敏的检测系统(J. Skeidsvoll和P.M. Ueland, AnalyticalBiochemistry, (1995) 231, 359-365)。已有若干报道，当采用荧光嵌入染料或嵌入剂时，通过CE-LIF对DNA分析可获得高的灵敏度。嵌入剂是平面型分子，其置于核酸碱基对或类似结构之间。嵌入剂与DNA或RNA结合后，其荧光增加了数倍，从而可检测少量核酸(U.S.专利5，734，058)。溴化乙锭(EB)是在凝胶电泳和毛细管电泳中最常用的DNA嵌入剂。据报道，除了荧光特性外，EB还对双链DNA (dsDNA)提供高的CE分辨率(Id.; H.-T. Chang和E.S. Yeung,同上)。通过EB获得的高分辨率CE分离已归结于当形成EB-DNA复合物时DNA电泳迁移率的降低。这种迁移率的降低随着DNA分子量的增加而增加(A.Guttman和N. Cooke, Anal. Chem. (1991) 63, 2038-2042)。然而，由于EB与DNA的结合相对较弱(Kdiss=l(T6M"),因此用EB检测DNA的灵敏度是低的。 一般而言，检测极限在凝胶lmmX5mm的条带上为约1 ng的双链DNA (dsDNA) (U.S.专利5,312,921)。近来，非对称花菁染料噻唑橙(TO; 4--喹啉锭碘化物)己经提示作为EB的替代物(U.S.专利5,312,921)。尽管该染料对DNA具有较高的亲和性，并且比EB灵敏度高10倍(Skeidsvoll & Ueland，同上)，但它却不能提供与EB—样的DNA分离性能。例如，尽管EB浓度不影响DNA分离，但当采用TO日寸，DNA分离的质量对DNA和染料的比率非常敏感。有报道，当DNA和染料的比率超出9:1时，DNA峰形大大变糟。结果，但采用TO时，观察到峰形变宽，以及峰高相对较低。对峰宽一种可能的解释是TO不仅嵌入而且结合到分离的DNA链上。此外，过量的TO有可能使DNA双螺旋结构去稳定，从而导致峰形变宽(H.E. Schwartz和K丄Ulfelder, Anal. Chem. 1992, 64, 1737-1740)。自从发现TO用作核酸染料以来，已经对TO及其trimethine同系物进行了若干改进，以提供与DNA结合更紧及水溶性更高的染料(U.S.专利5,321,130和U.S.专利5，312，921)。这些染料通常包括对染料的喹啉锭(quinolinium)部分加以改性，并且相当昂贵。总而言之，一些诸如EB的常规嵌入染料提供了高的DNA分辨率，但其亲和性和DNA检测灵敏度却较低。另一方面，其他诸如TO的常规嵌入染料提供了高的检测灵敏度，却不能提供理想的分辨率。因此，仍需要开发高分辨率/高灵敏度技术用于检测样品中的DNA，尤其是在DNA以极低浓度存在的地方。专利技术概述鉴于上述常规电泳系统存在的缺陷，本专利技术的目的是提供用于分离和检测核酸的高分辨率/高灵敏度的电泳方法。尤其希望提供一种在毛细管电泳中可实施的方法。通过提供一种电泳系统，使得其中的核酸从阴极向阳极迁移而高亲和性嵌入染料以反向迁移，本专利技术实现了上述这些及其他目的。因此，本专利技术的一个方面涉及通过电泳分离和检测样品中所含的核酸的方法。所述方法包括(a) 提供具有阳极端和阴极端的电泳系统；(b) 将样品上样到系统的阴极端；(c) 通过电极两端施加电压，让核酸在高分辨率缓冲液存在下从阴极端向阳极端迁移，从而分离样品中所含的核酸，其中高分辨率缓冲液的分辨率在271bp和282bp4)X174 Hae III核酸片段之间至少为2.0;(d) 将高亲和性嵌入染料上样到系统的阳极端，其中嵌入染料具有正电荷，以及DNA亲和常数至少为1(^M.1，以及其中嵌入染料在电极两端施加的电压下从阳极端向阴极端迁移，并且与分离的核酸形成复合物；以及(e) 检测复合物。高亲和性嵌入染料可选自噻唑橙(TO)， SYBR Green I， TO-PRO-l碘化物，TO-PRO-3碘化物，禾P TO-PRO-5碘化物(Molecular Probes;www.probes.com)。高分辨率缓冲液可包含高分辨率嵌入染料，其中高分辨率嵌入染料的分辨率在271bp和282bp 4>X174 Hae III核酸片段之间至少为2.0。在一个实施方案中，高分辨率染料选自溴化乙锭(EB)，碘化丙锭(PI)，和吖啶橙(Acidine Orange)(盐酸盐)。本专利技术的另一方面包括通过毛细管电泳(CE)分离和检测样品中所含的核酸的方法。所述方法包括(a) 提供具有阳极端和阴极端的毛细管，其中所述毛细管充满了高分辨率缓冲液，所述缓冲液的分辨率在271bp和282bp 4X174 Hae III核酸片段之间至少为2.0;(b) 将样品上样到毛细管的阴极端；Cc)通过在两电极之间施加电压，让核酸在高分辨率缓冲液存在下从阴极端向阳极端迁移，从而分离样品中所含的核酸；(d) 将高亲和性嵌入染料上样到毛细管的阳极端，其中嵌入染料具有正电荷，以及DNA亲和常数至少为106M"，以及其中嵌入染料在电极两端施加的电压下从阳极端向阴极端迁移，并且与分离的核酸形成复合物；以及(e) 检测复合物。本专利技术的另一方面涉及采用多嵌入染料通过CE和激光诱导荧光检测(CE-LIF)分离和检测样品中所含的核酸的方法。所述方法包括(a)提供具有阳极端和阴极端的毛细管，其中 述毛细管充满了含有高分辨率嵌入染料的凝胶缓冲液，所述嵌入染料的分辨率在271bp和282bp4)X174 Hae III核酸片段之间至少为2.0;(b) 将样品上样到毛细管的阴极端；(c) 通过在两电极之间施加电压，让核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过电泳分离和检测样品中核酸的试剂盒，所述试剂盒包括：　含高分辨率嵌入染料的凝胶缓冲液，所述嵌入染料的分辨率在２７１ｂｐ和２８２ｂｐ　φ　Ｘ１７４　Ｈａｅ　Ⅲ核酸片段之间至少为２．０；以及　高亲和性嵌入染料，其具有正电 荷以及ＤＮＡ亲和常数至少为１０６Ｍ↑［－１］。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘明孙，陈夫泰，
申请(专利权)人：贝克曼考尔特公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]