糖偶联物疫苗制造技术

本发明专利技术提供含有两种或多种单价偶联物相组合的组合物，所述两种或多种单价偶联物各自含有载体蛋白，所述载体蛋白包含偶联糖抗原的两种或多种病原体的Ｔ细胞表位。本发明专利技术也提供多价偶联物，其包含偶联于同一载体蛋白分子的两种或多种抗原性不同的糖抗原，所述载体蛋白包含两种或多种病原体的Ｔ细胞表位。其它组合物包含一种或多种所述单价偶联物和一种或多种所述多价偶联物。本发明专利技术还提供了制备所述组合物的方法和所述组合物的应用。实施例包括将Ｎ１９载体蛋白偶联于脑膜炎球菌寡糖。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术属于疫苗领域，涉及含有两种或多种糖抗原与多表位载体蛋白相偶联的新型组合物，所述多表位载体蛋白包含多种病原体蛋白质的T细胞表位。本专利技术也 涉及制备所述组合物的方法和所述组合物的应用。
技术介绍
本领域已知多价疫苗。 一个例子是多年来已知的脑膜炎奈瑟球菌(iV. /nem'"g/^fo) 血清组A、 C、 Y和W135的荚膜多糖四价疫苗，此疫苗已获批准用于人类。. 然而，虽然此疫苗在青少年和成年人中有效，但在婴儿中诱导的免疫应答差，保护 力持续时间短，因此不能用于婴儿。这是因为多糖是T细胞非依赖性抗原，通 常诱导的免疫应答不能作加强免疫。故常需关注该多价疫苗能否广泛应用，因为它 们可能造成对象的免疫功能显著下降，这称为免疫抑制。给予对象的抗原量超过免 疫系统的应答能力时，可能导致此种免疫抑制。这种状况称为抗原过载。免疫抑制 的发生也可能由于多价疫苗中的一种抗原组分阻止了免疫系统对其另一种抗原组分 产生应答。后一种免疫抑制形式称为疫苗干扰。在过去20年中，开发了包含细菌荚膜多糖与蛋白质载体相偶联的偶联疫苗。例 子包括b型流感嗜血杆菌(//^附0/7/ 7^ /wy we"zae)(Hib)偶联疫苗以及针对肺炎链 球菌和脑膜炎奈瑟球菌血清组C(MenC)的偶联疫苗。已经批准的疫苗中所用的载体蛋白包括破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、 白喉毒素的无毒CRM197突变体和脑膜炎奈瑟球菌血清组B的外膜蛋白复合物。由 于医学实践中正在引进更多的偶联疫苗，因此婴儿可能接受疫苗本身(如TT或DT) 或作为偶联疫苗中的载体蛋白形式的多次载体蛋白注射。由于这些蛋白质对B-和T-细胞具有高水平的免疫原性，这种载体过载可在初免个体中诱导免疫抑制。这种 现象称为载体诱导的表位抑制，认为这是由于载体特异性抗体和抗原分子内的竞争 所致。理想的是，载体蛋白应能诱导对偶联的B-细胞表位(如多糖)产生强大的辅助作用，而不诱导对其本身的抗体应答。采用在大多数II类主要组织相容性复合物 分子结合时有免疫原性的通用表位是达到此目的的一种方法。已在TT和其它蛋白 中鉴定到这种表位。然而，仍需要进一步改进。因此，本专利技术的目的是提供改进的糖偶联物。
技术实现思路
已发现多表位载体蛋白作为糖结合载体特别有用。而且已发现即使它们包 含许多已知的病原体表位，但观察到对这些载体蛋白也只产生低免疫应答，而且预 计此种免疫应答与病原体表位数量成比例提高。因此，在一些实施方式中，本专利技术提供了包含两种或多种单价偶联物(如2种、3种、4种、5种、6种或更多种，见附图说明图1A)相组合的组合物。各单价偶联物包含(i) 载体蛋白，其含有与(ii滩抗原相偶联的两种或多种(如2种、3种、4种、5种、6种 或更多种)病原体的T细胞表位。各偶联物中优选采用相同的载体蛋白。优选地，至 少一种载体蛋白表位不衍生自与糖抗原相同的病原体。优选没有任何载体蛋白表位 衍生自与糖抗原相同的病原体。虽然由于各载体蛋白分子上有多个连接位点(图1B)，而可将各单价偶联物中各 载体蛋白分子偶联于一种以上糖抗原分子(如l种、5种、10种、20种或更多种)， 但偶联于任何给定载体蛋白的各糖抗原优选来自抗原性不同的同一种病原体。例如， MenA的糖抗原不同于MenC、 MenW和MenY的糖抗原，因此称这些糖抗原来自抗 原性不同的病原体，而Hib的糖抗原都来自抗原性不同的同一种病原体。在一种偶 联物中，各糖抗原虽然来自抗原性不同的同一种病原体，但其链长度可以不同。另外，在一些实施方式中，本专利技术提供的多价偶联物含有偶联于相同载体蛋白 分子的两种或多种(如2种、3种、4种、5种、6种或更多种)抗原性不同的糖抗原(图 1C)。在这种情况下，糖抗原来自抗原性不同的病原体。因此，例如，在这种偶联组 合物中，各载体蛋白分子可偶联有MenA、 MenC、 MenW、 MenY和Hib中的两种或 多种糖抗原。本专利技术也提供了含两种或多种(如2种、3种、4种、5种、6种或更多 种)这些多价偶联物的组合物。另外，本专利技术提供的组合物含有上述一种或多种(如1种、2种、3种、4种、5 种、6种或更多种)单价偶联物和一种或多种(如1种、2种、3种、4种、5种、6种 或更多种)多价偶联物。载体蛋白所述载体蛋白可包含2种或多种T细胞表位(如2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100种或更多种)。载体 蛋白优选包含6种或更多种，或10种或更多种表位。更优选地，载体蛋白包含19 种或更多种表位。各载体蛋白可仅含有一个拷贝的特定表位，或可含有一个以上拷 贝的特定表位。所述表位优选CD4+T细胞表位。载体蛋白优选包含至少一种细菌表 位和至少一种病毒表位。所述表位优选衍生自人群通过天然感染或疫苗接种常常接 触的抗原，例如，这些表位可衍生自甲肝病毒、乙肝病毒、麻疹病毒、流感病毒、 水痘-带状疱疹病毒、牛型结核菌(M;;co6flc^7'ww6ov&)和麻风分枝杆菌(M /e; rae)和/ 或链球菌(&/^^00^0 )菌株等的热激蛋白。这些表位宜选自破伤风毒素(TT)、恶性 疟原虫(尸A^moo^m/a/c^an/m)CSP(PfCs)、乙肝病毒核衣壳(HBVnc)、流感病毒血凝 素(HA)、 HBV表面抗原(HBsAg)和流感基质(MT)。蛋白的表位载体蛋白中所用表位 宜选自P23TT(SEQIDNO: 1)、 P32TT (SEQ ID NO: 2)、 P21TT (SEQ ID NO: 3)、 PfCs(SEQIDNO: 4)、 P30TT (SEQ ID NO: 5)、 P2TT (SEQ ID NO: 6)、 HBVnc(SEQ ID NO: 7)、 HA (SEQ ID NO: 8)、 HBsAg (SEQ ID NO: 9)或MT (SEQ ID NO: 10)。所述表位宜通过间隔臂连接。间隔臂优选不是表位的短(如1、 2、 3、 4或5个) 氨基酸序列。优选的间隔臂包含一个或多个甘氨酸残基，如-KG-。载体蛋白优选含 有六-His尾和/或蛋白酶切割序列的N-或C-末端区，六-His尾是用于筛选载体蛋白的 免疫亲和标记(例如可采用序歹iJ"MDYKDDDD")。蛋白酶解序列优 选为因子Xa的识别位点。所述载体优选不包含抑制性T细胞表位。所述载体蛋白优选为N19(SEQIDNO: 11)。已证明，大肠杆菌(&c/zm'c/^ co//) 表达的称为N19的遗传工程改造蛋白含有几个人CD4+T-细胞通用表位，当将其 与Hib多糖偶联后具有强载体作用。 N19的N末端区域由以下部分组成(i)可用 于纯化的六His尾，(ii)克隆过程中用于筛选阳性克隆的兔多克隆抗体可识别的标记 肽Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp序列(SEQ ID NO: 12)， (iii)易于清除该标记的 因子Xa识别位点Ile-G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有两种或多种单价偶联物的组合的组合物，其中所述两种或多种单价偶联物各自包含（ｉ）载体蛋白，其包含偶联于（ｉｉ）糖抗原的两种或多种病原体的Ｔ细胞表位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G德尔古迪斯，K巴拉尔多，
申请(专利权)人：启龙有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]