本发明专利技术以分析多种血清群脑膜炎球菌混合糖的方法为基础，即使这些糖具有相同的单糖单元。本发明专利技术分析了血清群Ｃ、Ｗ１３５和Ｙ的糖的组合物中的唾液酸、葡萄糖和半乳糖含量。葡萄糖和半乳糖结果可分别用于直接定量血清群Ｙ和Ｗ１３５的糖，从唾液酸含量中扣除葡萄糖和半乳糖的合并含量而定量血清群Ｃ的糖。因此，可分辨这三种血清群，即使它们的单糖含量重叠。可分析同一物质中的三种不同单糖而不受单糖之间的干扰和该组合物中任何其它糖物质（例如，冻干稳定剂）的干扰。本方法可用于分析偶联疫苗中的全部糖和游离糖并简化了对含有多种血清群荚膜糖疫苗的质量控制。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及含有细菌荚膜糖，特别是与载体相偶联的糖的疫苗的分析和质量控制领域。
技术介绍
含有与载体蛋白相偶联的荚膜糖的免疫原为本领域所熟知。这种偶联将T细胞不依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原，从而提高了记忆应答并产生保护性免疫力，原型偶联物疫苗用于b型流感嗜血杆菌(Hib)。自Hib疫苗以来，开发了保护性的抗脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)(脑膜炎球菌)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎球菌)的偶联糖疫苗。感兴趣的偶联疫苗涉及的其它微生物有无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B族链球菌)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。人用的脑膜炎奈瑟球菌血清群C的偶联疫苗已获批准，包括MenjugateTM、MeningitecTM和NeisVac-CTM。混合的血清群A、C、W135和Y中各种偶联物已见报道，包括MenactraTM产品。偶联抗原的其它混合物包括(i)脑膜炎球菌A/C混合物；(ii)含有7种肺炎球菌偶联物的PrevNarTM产品；(iii)混合的脑膜炎球菌和Hib偶联物；和(iv)混合的脑膜炎球菌、肺炎球菌和Hib偶联物。偶联物疫苗所面对的问题包括稳定性和批次之间的一致性。例如，在Hib疫苗中，糖的催化性解聚已见报道，而脑膜炎球菌血清群A的荚膜的偶联物易于水解。偶联物的不稳定性不良地导致免疫原性偶联物的有效剂量随时间而降低，批次之间的差异和特性未知分解产物的水平增加。参考文献18和19讨论了Hib偶联疫苗的稳定性测试的有关问题。定量分析糖偶联物一般包括第一步骤糖水解，然后根据所释放的单糖进行分析。然而该分析只是直接相对于一种偶联物(例如，用阴离子交换层析方法分析Hib和脑膜炎球菌血清群A的水解偶联物)，混合疫苗，特别是当不同的糖均具有相同单糖单元时，情况更复杂。例如，脑膜炎球菌血清群C、W135和Y的荚膜糖均含有唾液酸，因此根据测定所释放的唾液酸的任何方法不能区分这3种血清群。本专利技术的目的是通过改进对偶联疫苗中糖的定量评估来评估其稳定性和完整性。具体地说，本专利技术的目的是提供可用于测定脑膜炎球菌混合偶联疫苗中每种偶联物的方法，从而改进疫苗的质量控制和一致性。
技术实现思路
本专利技术基于可分析脑膜炎球菌多种血清群的混合糖的方法，即使这些糖具有相同的单糖单元。因此，本专利技术提供一种分析组合物中糖含量的方法，其中(a)所述组合物含有脑膜炎奈瑟球菌血清群C的荚膜糖和以下一种或两种荚膜糖(i)脑膜炎奈瑟球菌血清群W135的荚膜糖；和/或脑膜炎奈瑟球菌血清群Y的荚膜糖；(b)所述方法包括分析组合物中唾液酸含量的步骤和(i)如果组合物含有血清群W135的糖，分析组合物中半乳糖含量的步骤；(ii)如果组合物含有血清群Y的糖，分析组合物中葡萄糖含量的步骤；(c)如果组合物含有血清群W135的糖，则根据步骤(b)的半乳糖分析结果测定组合物中血清群W135的糖含量。(d)如果组合物含有血清群Y的糖，则根据步骤(b)的葡萄糖分析结果测定组合物中血清群Y的糖含量。(e)通过比较唾液酸分析的结果与以下结果来测定组合物中血清群C的糖含量(i)如果组合物含有血清群W135的糖而不是血清群Y的糖，分析步骤(b)的半乳糖结果；(ii)如果组合物含有血清群Y的糖而不是血清群W135的糖，分析步骤(b)的葡萄糖结果；或(iii)如果组合物同时含有血清群W135的糖和血清群Y的糖，分析步骤(b)的葡萄糖和半乳糖联合结果。因此，当联用血清群C、W135和Y的糖时，本专利技术可以分析唾液酸、葡萄糖和半乳糖含量。利用葡萄糖和半乳糖的结果分别直接定量血清群Y和W135的糖，从唾液酸含量中减去葡萄糖和半乳糖含量之和来定量血清群C的糖。因此，可以分辨这三种血清群，即使它们的单糖含量重叠。本专利技术人有利地发现可对同一物质进行这三种不同的单糖分析，而单糖之间无干扰和与组合物中其它糖类物质(例如，冻干稳定剂)无干扰。该方法可用于分析偶联疫苗中总糖和游离糖，简化含有多种血清群的荚膜糖的疫苗的质量控制。分析醛糖、氨基己糖和唾液酸混合物而无干扰的方法已有描述，但该方法依赖于酶处理和化学衍生。相反，本专利技术的方法不需要这些步骤，因此能更快更易进行。此外，参考文献22所述的条件不会存在分辨具有相同单糖单元的不同糖的固有问题。本专利技术也提供了适用于执行本专利技术方法的计算机设备。具体地说本专利技术提供分析上述组合物中糖含量的计算机程序，包括用于以下操作的程序模块(a)接受样品的唾液酸含量、葡萄糖含量和/或半乳糖含量的数据；和(b)从这些数据计算血清群C和血清群W135和/或Y的荚膜糖含量。本专利技术也提供包括保存了本专利技术计算机程序的计算机可读存储介质的计算机程序产品。血清群C、W135和Y的荚膜糖本专利技术方法是用于脑膜炎球菌荚膜糖混合物。所述混合物包含(i)血清群C和(ii)血清群W135和Y的一种或两种的荚膜糖，即C+W135、C+Y或C+W135+Y。也可以存在其它糖。血清群C的荚膜糖是(α2→9)-连接唾液酸(N-乙酰基神经氨酸或“NeuNAc”)的均聚物。大多数血清群C菌株在唾液酸残基的C-7和/或C-8处含有O-乙酰基，但约15％的临床分离物缺乏这些O-乙酰基。乙酰化似乎不影响其保护性效力(例如，与MenjugateTM产品不同，NeisVac-CTM产品利用脱-O-乙酰基的糖，但两种疫苗均有效)。糖结构如附图说明图13所示，写成→9)-Neu p NAc7/8OAc-(α2→。血清群W135的糖是唾液酸-半乳糖二糖单元的均聚物。与血清群C的糖相似，它含有可变的O-乙酰化，但是在唾液酸7和9位。其结构如图14所示，写成→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→。血清群Y的糖与血清群W135的糖类似，除了二糖重复单元含葡萄糖而不是半乳糖(参见图16)。与血清群W135的糖相似，它在唾液酸7和9位含有可变化的O-乙酰化。血清群Y(糖)的结构如图15所示，写成→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→。因此，在含有血清群C、W135和Y荚膜糖的组合物中有三种不同的构成单体(葡萄糖、半乳糖和唾液酸)，这三种单体存在于水解后的混合物中。这种混合物中葡萄糖单体的含量与原初组合物中血清群Y糖的含量直接相关，半乳糖单体的含量与W135糖的含量直接相关。然而，对于血清群C情况更复杂唾液酸是可用于定量血清群C糖的唯一单体，但测定的混合物中唾液酸含量将包括血清群W135和Y的糖产生的单体。本专利技术通过以下方法克服了该分析的复杂性先测定混合物中半乳糖、葡萄糖和唾液酸各自的含量(分开和/或同时测定)，然后(a)利用半乳糖含量来定量水解前血清群W135的含量；(b)利用葡萄糖含量来定量水解前血清群Y的含量；(b)利用唾液酸含量与葡萄糖半乳糖含量之和的差异来定量水解前血清群C的含量，即根据唾液酸的摩尔量减去(葡萄糖+半乳糖)的摩尔量来计算血清群C的摩尔量。从唾液酸的摩尔含量中减去葡萄糖和半乳糖的摩尔含量纠正了血清群W135和Y的干扰，只得到血清群本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分析组合物的糖含量的方法，其中： （ａ）该组合物含有脑膜炎奈瑟球菌血清群Ｃ的荚膜糖和一种或两种以下荚膜糖：（ｉ）脑膜炎奈瑟球菌血清群Ｗ１３５的荚膜糖；和／或脑膜炎奈瑟球菌血清群Ｙ的荚膜糖； （ｂ）所述方法包括分析该组合物中唾液酸含量的步骤，和以下步骤：（ｉ）如果该组合物含有血清群Ｗ１３５的糖，分析该组合物中半乳糖含量的步骤；（ｉｉ）如果该组合物含有血清群Ｙ的糖，分析该组合物中葡萄糖含量的步骤； （ｃ）如果该组合物含有血清群Ｗ１３５的糖，根据步骤（ｂ）的半乳糖分析结果确定该组合物中血清群Ｗ１３５的糖的含量； （ｄ）如果该组合物含有血清群Ｙ的糖，根据步骤（ｂ）的葡萄糖分析结果确定该组合物中血清群Ｙ的糖的含量； （ｅ）比较唾液酸分析的结果与以下结果来确定该组合物中血清群Ｃ的糖的含量：（ｉ）如果该组合物含有血清群Ｗ１３５的糖但不含血清群Ｙ糖，步骤（ｂ）的半乳糖分析结果；（ｉｉ）如果该组合物含有血清群Ｙ的糖但不含血清群Ｗ１３５的糖，步骤（ｂ）的葡萄糖分析结果；或（ｉｉｉ）如果该组合物同时含有血清群Ｗ１３５的糖和血清群Ｙ的糖，合并步骤（ｂ）的葡萄糖和半乳糖分析结果。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A巴多蒂，D普罗蒂，S里奇，
申请(专利权)人：启龙有限公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。