1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟化硼(CDAP)能够活化多糖形成氰酸酯，而被用于多糖结合疫苗的制备工艺中；本发明专利技术提供一种多糖结合疫苗中残余CDAP的高效液相色谱检测方法，包括步骤：用CDAP标准品配制对照品溶液；将待检样品用超滤离心管进行离心，收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；供试品溶液和对照品溶液CDAP分别上样于高效液相色谱柱，上样后进行洗脱，记录色谱图；根据对照品溶液CDAP浓度及其色谱峰面积，供试品溶液CDAP色谱峰面积，采用外标法计算试样中CDAP的浓度。本发明专利技术方法简单、操作方便、精确度高，可准确、快速实现多糖结合疫苗中残余CDAP的有效监控。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于测试分析领域，具体为一种利用高效液相色谱测定CDAP的方法。
技术介绍
多糖结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合，抗原类型从 胸腺非依赖性抗原转变为胸腺依赖性抗原，能激发2岁以下儿童、老年人和免疫缺陷者 体内产生有效的免疫应答，并产生免疫记忆，诱导产生的保护性抗体主要为免疫球蛋白 (Immunoglobulin，Ig)G，比多糖疫苗诱导产生的IgM更有效，且能维持较长时间，具有多糖 疫苗不可比拟的优势。 在多糖结合疫苗的制备工艺中，通常采用活化剂如溴化氰对细菌多糖进行活化。 与溴化氰一样，1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟化硼（CDAP)能够活化多糖形成氰酸酯 (-0-C = N)。但相比于溴化氰，CDAP具有较强的活化效率且安全性高，被广泛的应用在多糖 结合疫苗的制造领域。虽然该物质毒性低，但为了对结合疫苗中残余CDAP进行有效监控， 准确测定多糖结合原液疫苗中CDAP的残留量对疫苗产品质量控制具有重要意义。目前，国外采用薄层色谱法（TLC)，仅能用来测定CDAP的纯度，国内尚无文献报道 多糖结合疫苗中CDAP残留量的测定方法，因此如何对多糖结合疫苗中CDAP残留量的测定 仍是一个技术难点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种多糖结合疫苗中残余CDAP高效液相色谱的检测方法。 通过该方法，可准确、快速实现多糖结合疫苗中残余CDAP的有效监控。 本专利技术所述的多糖结合疫苗中残余CDAP高效液相色谱测定方法，包括如下步骤： (1)用CDAP标准品配制对照品洛液； (2)待检样品用超滤离心管进行离心，收取滤过液用0.45 μ m膜过滤作为供试品 溶液； (3)供试品溶液和对照品溶液CDAP分别上样于高效液相色谱柱，上样后进行洗 脱，记录色谱图； (4)根据对照品溶液CDAP浓度及其色谱峰面积，供试品溶液CDAP色谱峰面积，根 据外标法计算试样中CDAP的浓度。 CDAP浓度计算公式如下所示： C2= (A2^-A1) XC1 (1) 式中： C2-试样中 CDAP 含量，ng/ml ; A2-供试品中CDAP色谱峰面积； A「对照品中CDAP色谱峰面积； C「对照品中 CDAP 含量，ng/ml。 CDAP含量计算公式如下所示： F = (C2+ C0) (2) 式中： F 试样中 CDAP 含量，ng/mg ; C2-试样中 CDAP 含量，ng/ml ; C。-试样中多糖含量，mg/ml ; 本专利技术的有益效果如下： 本专利技术提供的多糖结合疫苗中残余CDAP的高效液相色谱检测方法，在试样处理 中，用3K D的超滤管5000g离心20分钟排除了细菌多糖对CDAP测定的干扰，试样中CDAP 能得到良好分离和准确定量。两组加标样品中CDAP的回收率分别为94. 9%和95. 8%。本 专利技术方法简单、操作方便、精确度高，为试样中CDAP的测定提供了良好的条件，可以用于流 脑、HIB及肺炎等多种多糖结合疫苗中CDAP残余的测定。【附图说明】 图1为专属性测定结果【具体实施方式】 以下结合实施例对本专利技术做进一步描述，但不应用来限制本专利技术的范围。 实施例1 A群流脑多糖衍生物中CDAP残余的测定： 1.精密制取2000ng/ml CDAP标准溶液作为样品1 ; 2. A群流脑多糖衍生物用3KD的超滤管5000g离心20分钟，收取滤过液用0· 45 μ m 膜过滤作为供试品溶液；测定A群流脑多糖衍生物样品的糖浓度，为4. 67mg/ml (C。），取待 检的A群流脑多糖衍生物作为样品2 ; 3.样品1，样品2分别按照色谱条件进行上样检测； 色谱条件的设定： 3. 1流动相：乙臆-水-二氣乙酸（60 : 40 : 0· 1); 3.2色谱柱：(：18，了51^61005-100￥(4.6臟\250臟，5以111)，购自东曹生物科技有限 公司； 3. 3检测器：PDA检测器； 3. 4检测方法：色谱峰面积外标定量法； 3.5进样体积：15以1， 3. 6色谱柱温度：30°C ; 3. 7 流速：lml/min。 4.样品1，样品2的峰面积分别为：196778, 259714 ; 根据公式（1)计算试样中CDAP的浓度： C2= (A2^A1) XC1= (259714+196788) X2000 = 2639. 5ng/ml。 根据公式（2)计算A群多糖衍生物中CDAP的含量： F = C2 + C0= 2639. 5 + 4. 67 = 565. 20ng/mg。 实施例2 A群流脑多糖结合物原液中CDAP残余的测定： 1.精密制取2000ng/ml CDAP标准溶液作为样品1 ; 2. A群流脑多糖结合物原液用3KD的超滤管5000g离心20分钟，收取滤过液用 0. 45 μ m膜过滤作为供试品溶液；测定A群流脑多糖结合物原液样品的糖浓度，为0. 24mg/ ml (C。)，取待检的A群流脑多糖结合物原液作为样品2 ; 3.样品1，样品2分别按照色谱条件进行上样检测； 色谱条件的设定： 3. 1流动相：乙臆-水-二氣乙酸（60 : 40 : 0· 1); 3.2色谱柱：(：18，了51^61005-100￥(4.6臟\250臟，5以111)，购自东曹生物科技有限 公司； 3. 3检测器：PDA检测器； 3. 4检测方法：色谱峰面积外标定量法； 3. 5 进样体积：15 μ 1， 3. 6色谱柱温度：30 °C ; 3. 7 流速：lml/min。 4.样品1，样品2的峰面积分别为：204992,368 ; 根据公式⑴计算试样中CDAP的浓度： C2= (A2^A1) XC1= (368 + 204992) X2000 = 3. 59ng/ml。 根据公式（2)计算A群多糖衍生物中CDAP的含量： F = C2 + C0= 3. 59 + 0. 24 = 14. 96ng/mg。 本专利技术方法的方法学验证： 专属性验证： 由于在制备结合物过程中主要涉及以下化学物质，因此在进行方法专属性研究时 分别用10 μ g/ml浓度的CDAP标准品、水空白、乙腈、lmg/ml氯化钠、lmg/ml碳酸氢钠、Img/ ml ADH以及0. 1%的三乙胺按照实施例1中的方法进行检测，测试结果见附图1 : 10 μ g/ml浓度的CDAP在2. 526min明显单峰（见图1)，而氯化钠、碳酸氢钠 、ADH 以及0. 1 %的三乙胺成分在此位置未出现任何吸收峰，因此说明该方法对CDAP进行检测专 属性良好。检测限、定量限验证： 分别配制20-140ng/ml低浓度的CDAP标准样品，按照实施例1中方法进行进样检 测，结果如表1所示： 表1不同浓度CDAP信噪比（S/N)测定结果 当CDAP浓度为35ng/ml时S/N = 8,满足信噪比至少为3 : 1，初步确定为CDAP 的检测限；当CDAP浓度为40ng/ml时，信噪比约为10 : 1，确定40ng/ml的浓度为CDAP检 测的定量限。线性验证： 分别配制 160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml 及 4 μ g/ml 6 个浓度 的CDAP对照品溶液，按照实施例1中方法进行进样检测，实验结果如本文档来自技高网...
【技术保护点】
多糖结合疫苗中残余CDAP高效液相色谱测定方法，其特征在于包括如下步骤：(1)用CDAP标准品配制对照品溶液；(2)待检样品用超滤离心管进行离心，收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；(3)供试品溶液和对照品溶液CDAP分别上样于高效液相色谱柱，上样后进行洗脱，记录色谱图；(4)根据对照品溶液CDAP浓度及其色谱峰面积，供试品溶液CDAP色谱峰面积，采用外标法计算试样中CDAP的浓度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张晓华，孙述学，王震，褚自青，周荔葆，王振业，刘晓磊，李晓帆，
申请(专利权)人：北京成大天和生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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