一种冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将羊毛脂和液体石蜡加温水浴，置研钵中，然后将卡介苗加入研钵，边加边研磨，研磨均匀在8磅高压20min备用；本发明专利技术所述方法制备的冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗，使用低剂量的多糖抗原可达到与高剂量抗原相同的免疫效果。本发明专利技术所述方法步骤简单，可工业化生产，经济效益好。

Method for preparing cold phenol method Neisseria gonorrhoeae polysaccharide vaccine

The invention relates to a preparation method of a kind of cold phenol method of Neisseria gonorrhoeae polysaccharide vaccine, which comprises the following steps: lanolin and liquid paraffin heated water bath, the mortar, and then adding BCG mortar, side edge grinding, grinding at 8 pounds pressure 20min standby; the invention of the cold phenol method of Neisseria gonorrhoeae the preparation method of fungus polysaccharide vaccine, polysaccharide antigen using low dose can achieve the same immune effect and high dose of antigen. The method of the invention has the advantages of simple steps, industrialized production and good economic benefit.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备方法。
技术介绍
淋病奈瑟菌简称淋球菌，是引起淋病的病原菌，革兰染色阴性，常成双排列，无鞭毛、芽孢，有荚膜和菌毛，可携带多种质粒。人类是淋球菌的自然宿主。淋病具有潜伏期短、传染性强、社会危害性大等特点，主要通过性生活传播，也可通过污染的衣裤、床上用品、毛巾、浴盆、马桶等间接传播。目前常用的抗生素治疗虽然可以缩短淋球菌感染持续时间并减少其传播，但近年来随着淋球菌耐药菌株的不断出现，抗生素治疗淋病的耐药现象日趋严重，迫切需要寻找有效预防措施，但目前尚无临床应用的淋病奈瑟菌疫苗。淋球菌在进化过程中形成了一套逃避人体免疫系统的机制，制备淋球菌疫苗进行主动免疫预防较困难。尽管如此，人们仍在不懈地研制淋病奈瑟菌疫苗。多年以来，相关学者通过对淋球菌灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗等的深入研究，不断探索高效的疫苗靶位用于淋病的预防和控制，有力地推动了淋病奈瑟菌疫苗的研究。Ａ群脑膜炎球菌多糖疫苗已广泛应用于临床实践，使全国流脑发病率持续下降，取得了明显成绩。淋病奈瑟菌与脑膜炎球菌同属奈瑟菌属，具有许多共性，由此可设想淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备具有可行性。
技术实现思路
本专利技术提出一种冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备方法。一种冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1）将羊毛脂和液体石蜡加温水浴，置研钵中，然后将卡介苗加入研钵，边加边研磨，研磨均匀在8磅高压20min备用；（2）淋球菌接种于巧克力培养基，在37℃环境烛缸培养48h；（3）收获淋病奈瑟菌后以0.5％甲醛灭菌，4000r/min，离心15min，收集上清液，于上清液中滴入数滴十六烷基三甲基溴化铵；（4）室温下过夜，13000r/min，离心3，收集沉淀物；（5）沉淀物溶于2mol/L氯化钙溶液，至终浓度为1mol/L，摇动1h，充分解离多糖十六烷基三甲基溴化铵；（6）加入75％乙醇至终浓度为25％，过夜，16000r/min，离心15min去沉淀，收集上清液；（7）于上清液中加入冷却乙醇至终浓度为80％，充分振摇；沉淀多糖，16000r/min，离心30min，收集沉淀多糖，然后用无水乙醇及丙酮各洗涤2次，第1次13000r/min，离心5min；（8）第2次16000r/min，离心30min；将沉淀物，即多糖粗制品保存在－20℃以下备用；（9）将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml，然后将1倍体积多糖上清液加入2倍体积冷酚充分振摇，重复提取3次；（10）然后16000r/min，离心10min，收最上层澄清液体，重复3次并用0．1mol/l氯化钙溶液透析；（11）透析后离心，于上清液中加乙醇至最终浓度为75％-80％；（12）以16000r/min，离心30min，收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗涤2次；（13）用无热原蒸馏水溶解沉淀后即得。优选地，所述步骤（9）浓度为15mg/ml。优选地，所述步骤（11）浓度为78％。本专利技术所述方法制备的冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗，使用低剂量的多糖抗原可达到与高剂量抗原相同的免疫效果。本专利技术所述方法步骤简单，可工业化生产，经济效益好。具体实施方式实施例1。一种冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1）将羊毛脂和液体石蜡加温水浴，置研钵中，然后将卡介苗加入研钵，边加边研磨，研磨均匀在8磅高压20min备用；（2）淋球菌接种于巧克力培养基，在37℃环境烛缸培养48h；（3）收获淋病奈瑟菌后以0.5％甲醛灭菌，4000r/min，离心15min，收集上清液，于上清液中滴入数滴十六烷基三甲基溴化铵；（4）室温下过夜，13000r/min，离心3，收集沉淀物；（5）沉淀物溶于2mol/L氯化钙溶液，至终浓度为1mol/L，摇动1h，充分解离多糖十六烷基三甲基溴化铵；（6）加入75％乙醇至终浓度为25％，过夜，16000r/min，离心15min去沉淀，收集上清液；（7）于上清液中加入冷却乙醇至终浓度为80％，充分振摇；沉淀多糖，16000r/min，离心30min，收集沉淀多糖，然后用无水乙醇及丙酮各洗涤2次，第1次13000r/min，离心5min；（8）第2次16000r/min，离心30min；将沉淀物，即多糖粗制品保存在－20℃以下备用；（9）将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml，然后将1倍体积多糖上清液加入2倍体积冷酚充分振摇，重复提取3次；（10）然后16000r/min，离心10min，收最上层澄清液体，重复3次并用0．1mol/l氯化钙溶液透析；（11）透析后离心，于上清液中加乙醇至最终浓度为75％-80％；（12）以16000r/min，离心30min，收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗涤2次；（13）用无热原蒸馏水溶解沉淀后即得；（14）所述步骤（9）浓度为15mg/ml。实施例2。一种冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1）将羊毛脂和液体石蜡加温水浴，置研钵中，然后将卡介苗加入研钵，边加边研磨，研磨均匀在8磅高压20min备用；（2）淋球菌接种于巧克力培养基，在37℃环境烛缸培养48h；（3）收获淋病奈瑟菌后以0.5％甲醛灭菌，4000r/min，离心15min，收集上清液，于上清液中滴入数滴十六烷基三甲基溴化铵；（4）室温下过夜，13000r/min，离心3，收集沉淀物；（5）沉淀物溶于2mol/L氯化钙溶液，至终浓度为1mol/L，摇动1h，充分解离多糖十六烷基三甲基溴化铵；（6）加入75％乙醇至终浓度为25％，过夜，16000r/min，离心15min去沉淀，收集上清液；（7）于上清液中加入冷却乙醇至终浓度为80％，充分振摇；沉淀多糖，16000r/min，离心30min，收集沉淀多糖，然后用无水乙醇及丙酮各洗涤2次，第1次13000r/min，离心5min；（8）第2次16000r/min，离心30min；将沉淀物，即多糖粗制品保存在－20℃以下备用；（9）将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml，然后将1倍体积多糖上清液加入2倍体积冷酚充分振摇，重复提取3次；（10）然后16000r/min，离心10min，收最上层澄清液体，重复3次并用0．1mol/l氯化钙溶液透析；（11）透析后离心，于上清液中加乙醇至最终浓度为75％-80％；（12）以16000r/min，离心30min，收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗涤2次；（13）用无热原蒸馏水溶解沉淀后即得；（14）所述步骤（9）浓度为15mg/ml；（15）所述步骤（11）浓度为78％。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将羊毛脂和液体石蜡加温水浴，置研钵中，然后将卡介苗加入研钵，边加边研磨，研磨均匀在8磅高压20min备用；（2）淋球菌接种于巧克力培养基，在37℃环境烛缸培养48h；（3）收获淋病奈瑟菌后以0.5％甲醛灭菌，4000r/min，离心15min，收集上清液，于上清液中滴入数滴十六烷基三甲基溴化铵；（4）室温下过夜，13000r/min，离心3，收集沉淀物；（5）沉淀物溶于2mol/L氯化钙溶液，至终浓度为1mol/L，摇动1h，充分解离多糖十六烷基三甲基溴化铵；（6）加入75％乙醇至终浓度为25％，过夜，16000r/min，离心15min去沉淀，收集上清液；（7）于上清液中加入冷却乙醇至终浓度为80％，充分振摇；沉淀多糖，16000r/min，离心30min，收集沉淀多糖，然后用无水乙醇及丙酮各洗涤2次，第1次13000r/min，离心5min；（8）第2次16000r/min，离心30min；将沉淀物，即多糖粗制品保存在－20℃以下备用；（9）将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10～20mg/ml，然后将1倍体积多糖上清液加入2倍体积冷酚充分振摇，重复提取3次；（10）然后16000r/min，离心10min，收最上层澄清液体，重复3次并用0．1mol/l氯化钙溶液透析；（11）透析后离心，于上清液中加乙醇至最终浓度为75％‑80％；（12）以16000r/min，离心30min，收集沉淀物，用无水乙醇及丙酮各洗涤2次；（13）用无热原蒸馏水溶解沉淀后即得。...

【技术特征摘要】
1.一种冷酚法淋病奈瑟菌多糖疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将羊毛脂和液体石蜡加温水浴，置研钵中，然后将卡介苗加入研钵，边加边研磨，研磨均匀在8磅高压20min备用；（2）淋球菌接种于巧克力培养基，在37℃环境烛缸培养48h；（3）收获淋病奈瑟菌后以0.5％甲醛灭菌，4000r/min，离心15min，收集上清液，于上清液中滴入数滴十六烷基三甲基溴化铵；（4）室温下过夜，13000r/min，离心3，收集沉淀物；（5）沉淀物溶于2mol/L氯化钙溶液，至终浓度为1mol/L，摇动1h，充分解离多糖十六烷基三甲基溴化铵；（6）加入75％乙醇至终浓度为25％，过夜，16000r/min，离心15min去沉淀，收集上清液；（7）于上清液中加入冷却乙醇至终浓度为80％，充分振摇；沉淀多糖，16000r/min，离心30min，收集沉淀多糖，然后用无水乙醇及丙酮各洗涤2次，第1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊，
申请(专利权)人：陕西易阳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61