聚合物-von Willebrand因子偶联物制造技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质构建体（也称为聚合物－ＶＷＦ偶联物），其包含血浆的和／或重组的ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ），所述ＶＷＦ结合于至少一种生理学可接受的聚合物分子，而且还涉及一种所述蛋白质构建体与至少一种凝血因子Ⅷ（ＦⅧ）蛋白质的复合体。该生理学可接受的聚合物分子例如可以是聚乙二醇（ＰＥＧ）或聚唾液酸（ＰＳＡ）。本发明专利技术进一步涉及到一种用于延长哺乳动物血液中ＶＷＦ或ＦⅧ的体内半衰期的方法，其中哺乳动物具有与ＦⅧ或ＶＷＦ中的至少一种功能性缺乏或不足有关的出血病症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及到一种包含源于血浆的和/或重组的von Willebrand因子的蛋白质构建体 (VWF)或其生物活性衍生物，所述VWF或所述其生物活性衍生物结合于一种或多种生理 学可接受的聚合物分子，其中蛋白质构建体的体内半衰期在哺乳动物尤其是人的血液中得以 延长。进一步地，本专利技术涉及一种所述蛋白质构建体与至少一种因子FVIII (FVIII)蛋白或 其生物活性衍生物之间的复合体，其中所述FVIII蛋白或所述其生物活性衍生物的体内半衰期也在哺乳动物血液中得以延长。另外，本专利技术提供了含有所述蛋白质构建体或所述复合体 的药物组合物、以及使用所述蛋白质构建体或所述复合体来用于延长哺乳动物血液中VWF 或FVm的体内半衰期的方法，其中哺乳动物带有与FVIII和VWF的至少一种功能性缺乏或 者不足有关的出血病症。本专利技术还提供了生产蛋白质构建体的方法。 本专利技术的一个方面涉及一种含有源于血浆的和/或重组的VWF或者其生物活性衍生 物的蛋白质构建体(下述也称为"聚合物-VWF偶联物")，所述VWF或所述其生物活性衍 生物结合于一种或多种类型的生理学可接受的聚合物分子，其中所述VWF或者所述其生物 活性衍生物的体内半衰期在哺乳动物血液中得以延长。 本专利技术的另一个目的在于提供聚合物-vwf偶联物，其遵循两个基本的药理学机制， 并且呈现出具有介于所述两种形态中间的特征的所述聚合物-vwf偶联物的形式。 一种形式 稳定地将偶联的聚合物加载于vwf，并且将作为完整的分子在应用于哺乳动物后随着时间的 过去被排除。另一种形式通过聚合物偶联vwf的可逆性得以表征。在给药于哺乳动物后， 结合于vwf的聚合物分子将逐渐从vwf上释放，并且未偶联的vwf将作为药理学功能试 剂变得可用。该释放特性将取决于偶联化学，并且取决于组合物和结合于VWF的聚合物分 子结构。 聚合物-VWF偶联物既可单独用于VWD治疗，也可以与FVIII组合以稳定FVIII而 用于提高其半衰期或者提高二者的半衰期。当单独用于VWD治疗时，偶联物可以采用两种 形式中的一种。第一种形式是聚合物可释放地结合于VWF。在这种方式下，当聚合物释放或 者降解时，VWF变得有活性。第二种形式是结合于VWF的聚合物浓度不至于抑制VWF活 性。当制备出偶联物以结合并稳定fviii时，提供的结合于vwf的聚合物程度或水平不至于 妨碍VWF的结合区域。从实施例中将会看到，在不抑制VWF和FVIII结合能力的情况下， 可以实现令人满意的聚合物偶联于VWF。还可以控制或者改进聚合物偶联程度以保持VWF 活性，同时也保持VWF结合FVIII的能力。这种聚合物-VWF偶联物形式提供了治疗活性的 VWF，同时也能稳定FVin以提高半衰期。用于本专利技术的VWF和FVIII分子包括全长蛋白质、蛋白质前体、蛋白质亚基或片段，和其功能性衍生物。至于vwf和Fvin或fviii，是指包括这种蛋白质的全部潜在形式。在此使用的"生物活性衍生物"，包括任何具有与所述分子基本上相同功能的和/或生物特性(比如结合特性)的分子衍生物、和/或相同结构基础(比如肽骨架或基本聚合单元) 的分子衍生物。用于本专利技术的VWF包括所有潜在形式，包括单体形式和多聚形式。尤其有用的一种VWF形式是至少两个VWF的同型多聚体。VWF蛋白质既可以是生物活性衍生物，而当单 独作为FVIII稳定剂使用时，VWF也可以是无生物活性的形式。应当理解，本专利技术也包括将 各种形式的VWF组合使用。例如，用于本专利技术的组合物可以包括不同的多聚体、不同的衍 生物、以及兼具生物活性衍生物和无生物活性衍生物。在最初的止血中，VWF在血小板和细 胞外基质特定组分(比如胶原)之间用作架桥。在该过程中，VWF的生物活性可以通过两种 不同的体外分析方法来测量(Turecek等，Semin. Thromb. Hemost. 28: 149-160， 2002)。瑞 斯托菌素辅助因子分析法是基于在VWF存在时新鲜的或者福尔马林固定的血小板凝集而进 行的，该血小板由抗生素瑞斯托菌素(ristocetin)诱导产生。血小板的凝集程度取决于VWF 浓度，并且可以通过浊度测定法测量，例如通过使用集合度计(aggregometer)而进行(Weiss 等，J. Clin. Invest. 52: 2708-2716， 1973; Macfarlane等，Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308， 1975)。第二种方法是基于ELISA技术的胶原结合分析(Brown和Bosak， Thromb. Res. 43: 303-311， 1986; Favaloro， Thromb. Haemost. 83: 127-135， 2000)。微量滴定板用I型或者 III型胶原涂布。然而VWF结合于胶原表面，并且接着用酶标记的多克隆抗体检测。最后一 步是底物反应，其能够用ELISA阅读机进行光度测定监控。 在此使用的"源于血浆的VWF (pdVWF)"，包括血液中发现的所有形式蛋白质， 包括从哺乳动物中得到的成熟VWF，其具有体内稳定(例如结合)至少一个FVIII分子的特 性。然而，本专利技术不限于成熟VWF。其中之一，所述pVWF的生物活性衍生物是含有前肽 (pro-peptide)的前VWF。用于本专利技术的其它VWF形式包括蛋白质构建体，其含有包括由 内皮细胞和巨核细胞合成的前体VWF分子(在先前VWF)的未成熟VWF，和/或前体分子 的VWF前肽(前VWF)以及/或在前体分子的信号肽和前肽裂解时得到的成熟pdVWF。 pdVWF的生物活性衍生物例子进一步包括前体药物，其加工或转变为生物学活性形式，或者 生物学活性的诸如截短形式、缺失形式、替换形式、除前述形式之外的附加形式、成熟形式 片段、嵌合形式、以及相比于天然形式的翻译后修饰形式。用于本专利技术的pVWF也包括那些 无生物活性的形式。这可以通过修饰成熟VWF或其它血液中发现的天然存在的形式来完成。 用于本专利技术VWF的来源是哺乳动物，包括猪和人类模型在内。 在此使用的"重组VWF (rVWF)"，包括经由DNA重组技术得到的VWF。 一种 有用的rVWF形式至少具有体内稳定(例如结合)至少一个FVIII分子的特性，并任选地具 有药理学可接受的糖基化模式。具体的例子包括无A2结构域因而抗蛋白水解的VWF (Lankhof等，Thromb. Haemost. 77: 1008-1013,1997)、包含糖蛋白Ib结合结构域和胶原及 肝素结合位点的从缬氨酸449到天冬酰胺730的VWF片段(Pietu等，Biochem. Biophys. Res.Commun. 164: 1339-1347， 1989)。根据本
已知的方法可以在缺乏VWF的哺乳动 物中进行稳定至少一种FVm分子的测定。例如，在下面实施例8描述到，用VWF经由尾部 静脉进行静脉治疗缺乏VWF的小鼠，并且血浆中FVIII活性水平随着时间而变。FVIII活性 水平例如可以通过欧洲药典公布的显色分析法(Ph.Eur.，第三版，1997:2.7.4)测量。 含有FVIII (FVIII:C)的样品与凝血酶、活化凝血因子IX (FIXa)、磷脂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质构建体，含有：　　　　（ａ）一种ＶＷＦ分子，其选自由源于血浆的ｖｏｎ　　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ＶＷＦ）、重组ＶＷＦ、ＶＷＦ的生物活性衍生物、及它们的二聚体和多聚体所组成的组；以及　　　　（ｂ）至少一种结合于所述ＶＷＦ分子的生理学可接受的聚合物分子；　　　　所述构建体具有结合至少一种凝血因子（ＦⅧ）分子或ＦⅧ的生物活性衍生物的能力，其中所述构建体的体内半衰期同ＶＷＦ分子的体内半衰期相比有增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗里德里沙伊夫林格尔，皮特图雷切克，于尔根西克曼，
申请(专利权)人：巴克斯特国际公司，巴克斯特保健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]