本发明专利技术公开一种动物华支睾吸虫病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒，该特异性引物其上游引物核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示，下游引物核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示。本发明专利技术用上述特异性检测引物对待测模板ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外光下观察，阳性结果会出现特异性扩增条带，阴性结果则不会出现。本发明专利技术根据动物华支睾吸虫病的ＩＴＳ区序列数据库设计特异性检测引物，建立了用于动物华支睾吸虫病诊断的快速、特异、敏感的ＰＣＲ方法，可准确地鉴定动物华支睾吸虫病。本发明专利技术的试剂盒操作简单程序化，方法特异性强，敏感性高，结果判定客观，可用于动物华支睾吸虫病的诊断和流行病学调查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物华支睾吸虫病的基因学鉴定，特别是涉及动物华支睾吸虫 病特异性检测引物、检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
华支睾吸虫病是由后睾科支睾属的华支睾吸虫(ao"orc/^w'"era/s)寄生 于犬、猫、猪等动物及人胆管内所引起的一种重要的人兽共患寄生虫病，俗称 肝吸虫病。华支睾吸虫寄生在淡水螺、淡水鱼、淡水虾、犬、猪、牛、鼠、家兔、豚 鼠、狐狸和家禽等动物，人为终末宿主，本病可使肝脏肿大并导致其他肝病变， 病情多呈慢性经过，临床上可见精神沉郁，食欲减退和下痢等症状，重者可致肝硬化甚至癌变，少数儿童和青少年患者可致侏儒症，并发症多达21种，对人类健康的影响不容忽视。华支睾吸虫病呈地方性流行，在东南亚国家较常见，该病在我国已有很长 的历史，流行广泛，目前华支睾吸虫病有逐年上升的趋势，其发生和流行除了 跟人们的一些不良饮食习惯如生食鱼虾等有关系外，其中间宿主(淡水螺、淡 水虾等)以及保虫宿主(保虫宿主有猫、犬、猪、牛、鼠、狐狸和家禽等动物) 在其流行过程中是十分重要和关键的环节。分子生物学方法已开始应用于华支睾吸虫的分子鉴定上。PCR以其高度 的特异性和敏感性，已广泛应用于分子生物学研究的各个领域，尤其对各种病 原体的检测和疾病的诊断中。目前，在寄生虫学领域，用于疾病诊断和虫体检测的PCR方法很多，如常规PCR、反转录PCR、套式PCR、免疫磁性捕获 PCR、荧光定量PCR (FQ-PCR)等。Le (Le TH， Van De N， Blair D, et al. Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini: development of a mitochondrial-based multiplex PCR for their identification and discrimination. Exp Parasitol. 2006,112(2): 109-14)通过设i十两 对线粒体DNA引物，用多重PCR方法成功对华支睾吸虫和麝猫后睾吸虫进行 鉴别诊断，能检测到最低样品DNA量为0.78ng; Parvathi等(Parvathi A, Jieyuan L， Iddya K, et al. C7o"wr/^ w'"e脂、Development and evaluation of a nested polymerase chain reaction (PCR) assay. Exp Parasitol, 2007,115(3):291-295)首先 对华支睾吸虫的基因组用随机引物进行扩增测序，选择合适的部位设计两对引 物进行巢式PCR，结果表明，该方法具有很好的敏感性和特异性，能检测到 鱼肉中最低华支睾吸虫囊呦的DNA为10'5ng，有望在华支睾吸虫鱼的流行情 况调查以及动物的粪便检査中得到应用。人体华支睾吸虫病诊断技术的研究一直是医学研究中的一个热点，已建立 了多种诊断检测方法，包括虫卵检查、皮内试验(IT)、 B超、CT、间接血凝 免疫吸附试验(ELISA)、单克隆抗体ELISA (McAb-ELISA)以及免疫胶体 金方法等，但在兽医领域，均未见应用于动物华支睾吸虫病的诊断，目前动物 华支睾吸虫病主要还是依靠粪检患畜虫卵的方法进行流行病学调查，因为此种 方法敏感性不高，极易漏检，也易误诊。从粪便中提取DNA—直是个难点，粪便的成分复杂，含有各种各样抑制 PCR的物质，如胆盐、多糖等。目前能从粪便中提取DNA的方法要么就是需 要繁琐的步骤，如免疫磁性分离法、梯度离心法、荧光激活细胞分选术等，要么就是需要用到昂贵的DNA提取试剂盒。如能用快速、简便的方法从粪便中提取到寄生虫的DNA，将会有重大的意义，能对疾病进行及早的诊断，预防疾病的发生。PCR检测方法敏感性高、 一次检测大量样品、避免主观偏差等优越性预示着它在特异性诊断、流行病学调查和药物治疗监控等方面有着广阔的应用前 景。内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)是核糖体DNA中介于 18S和28S之间的内转录间隔区，包括第一、第二内转录间隔区(ITS-l和ITS-2) 两段序列，ITS序列存在于高度重复的核糖体中，进化速度快且长度不大，加 上协同进化使该片段在基因组不同单元间十分一致，因而十分适合进行各种分 子操作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种通过对动物华支睾吸虫 病ITS序列进行分析，设计得到的能专一性鉴别动物华支睾吸虫病的动物华支 睾吸虫病特异性检测引物。本专利技术的另一个目的是提供一种运用上述动物华支睾吸虫病特异性检测 引物对动物华支睾吸虫病进行简便、高效的特异性检测的方法。本专利技术的另一个目的是提供含有上述动物华支睾吸虫病特异性检测引物 的试剂盒。本专利技术的上述目的是通过如下方案予以实现的本专利技术人根据华南农业大学兽医寄生虫研究室已测得的华支睾吸虫ITS 序列，还有来自GenbankTM的猫后睾吸虫和部分麝猫后睾吸虫ITS序列，以及其它一些寄生于肝脏的吸虫的ITS序列进行比对，设计出能专一性鉴别动物华 支睾吸虫病的特异性引物，通过PCR扩增来鉴定动物华支睾吸虫病。上述特异性引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: l所示，下游 引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 2所示。采用上述特异性引物，用常规的PCR方法即可实现动物华支睾吸虫病的 特异性检测。一种动物华支睾吸虫病特异性检测方法，包括如下步骤(1) 华支睾吸虫囊呦DNA的提取或虫卵DNA的提取；(2) 以步骤(1)提取的DNA为模板，采用上述动物华支睾吸虫病特异 性检测引物(上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO: l所示，下游引物的核苷 酸序列如SEQ ID NO: 2所示)进行常规PCR扩增；(3) PCR扩增反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，紫外光下观 察特异性扩增条带，阳性结果会出现特异性扩增条带，阴性结果则不会出现；上述步骤(2)中，PCR扩增条件采用常规操作即可实现本专利技术；实际应 用时还可选择如下PCR扩增体系总体系为2.5ml，含有上述动物华支睾吸虫 病特异性检测引物，终浓度各为0.5pmol4d; pH8.3的Tris-HCl,终浓度为 10mM; KC1，终浓度为50mM， 4个dNTP (dATP、 dTTP、 dGTP和dCTP)， 终浓度各200iaM， MgCl2，终浓度为2.5mM; Taq DNA聚合酶按每个PCR反 应含0.625U加入。上述步骤(3)中，PCR扩增反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果， 紫外光下观察特异性扩增条带，以华支睾吸虫阳性DNA作为阳性对照品，以 无DNA超纯水作为阴性对照，待检样品若观察到一条与华支睾吸虫阳性对照同一位置出现的400 bp的片段，而该位置处阴性对照没有条带，则说明该待 测样品感染有华支睾吸虫病。针对上述检测方法，本专利技术人从MgCl2的浓度和退火温度两方面进行调整来优化PCR扩增条件，MgCl2的浓度梯度分别为1.5mM、 2.0mM、 2.5mM、3.0mM和3.5mM、 4.0mM，退火温度梯度分别为50°C、 54°C、 58°C、 61。C和68°C，以期本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种动物华支睾吸虫病特异性检测引物，其上游引物的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示，下游引物的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱兴全，林瑞庆，唐剑栋，宋慧群，邓艳，袁子国，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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