【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，特别是涉及一种以fabl基因作为抗性标记的枯草芽孢杆菌无抗性表达系统及其构建方法与应用。
技术介绍
1、酶制剂的生产在医药、食品等方面存在着日益紧张的需求，由于微生物具有能够进行异源蛋白胞外分泌表达、适应性广、稳定性强等优点，这使得以微生物发酵作为生产方式的模式成为主流。但在生产过程中，如利用微生物发酵时所使用的游离质粒表达重组菌株总是需要引入抗性标记基因来进行筛选，这就会造成在食品安全级别的生产中带来抗生素污染等情况而受到使用限制。也有很多研究通过将异源蛋白表达的操纵子整合至基因组的方法达到无抗性标记生产的目的，但存在整合拷贝数低，远不及游离质粒的复制量，蛋白表达量低的问题，而多拷贝整合在研究中发现当拷贝数超过某一特定值时二者呈负相关，会给宿主生长带来负担且由于传统同源重组整合效率低、cas9定点整合质粒过大、多拷贝整合过程繁琐等使得蛋白无抗性标记表达急需新的解决方案的出现。
2、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)被公认为是安全菌株(gras)，同时因为枯草芽孢杆菌生长迅速、培养条件简单、具有良好的发酵基础和生产技术等优点，使其在科研和工业、农业生产领域被广泛应用。其作为一种重要的工业微生物，具有开发为食品级表达宿主的优势。
3、目前枯草芽孢杆菌中表达蛋白大都采用质粒表达，用质粒拷贝数多，蛋白表达量大，但其中质粒上都带有抗性基因，在食品级安全表达蛋白中是不符合要求的；而整合表达可以去除抗性，但拷贝数少，表达量低。因此建立一套枯草芽孢杆菌的无抗生素抗性标记基因的表达
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种以fabl基因作为抗性标记的枯草芽孢杆菌无抗性表达系统及其构建方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统的构建方法，所述表达系统以fabl基因作为抗性标记。
4、优选的是，包括以下步骤：
5、(1)构建枯草芽孢杆菌fabl基因缺失突变株；
6、(2)构建以fabl基因作为抗性标记表达载体；
7、(3)将所述以fabl基因作为抗性标记表达载体转化所述枯草芽孢杆菌fabl基因缺失突变株，即为所述枯草芽孢杆菌无抗性表达系统。
8、优选的是，所述构建枯草芽孢杆菌fabl基因缺失突变株具体为：
9、构建敲除载体prp1028-fabl转入大肠杆菌，得到prp1028-fabl/dh5α菌株，随后将prp1028-fabl/dh5α菌株和枯草芽孢杆菌以及pss1827/dh5α菌株进行三亲本杂交，筛选得到枯草芽孢杆菌168fabl基因敲除完成的菌株，即为所述枯草芽孢杆菌fabl基因缺失突变株。
10、优选的是，所述构建以fabl基因作为抗性标记表达载体具体为：以质粒pht254作为模板，将氨苄青霉素抗性基因ampr替换为fabl基因，同时删除cm抗性片段，获得表达载体pht254-l。
11、优选的是，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168。
12、本专利技术还提供所述构建方法得到的枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统。
13、本专利技术还提供一种以fabl基因作为抗性标记表达载体，所述表达载体为pht254-l。
14、本专利技术还提供所述枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统或所述表达载体在安全表达蛋白产品中的应用。
15、烯脂酰acp还原酶(enoyl-acyl carrier protein reductase，enr)是ⅱ型脂肪酸合成系统中的一个关键酶，催化每个延伸循环的最后一步还原，即反式-2-烯脂酰acp还原为饱和的脂酰acp。许多细菌都编码enr，在序列上有较高的同源性(>40％)，都含有保守的tyr-(xaa)6-lys催化活性中心序列，但enr在不同细菌中显示出结构多样性。最早在大肠杆菌中发现的enr命名为fabi，通过序列比对在许多基因组中都能找到fabi同源基因。fabi蛋白是广谱抗菌剂三氯生的靶标。
16、三氯生(triclosan，tcl)作为一种慢结合抑制剂，通过与活性部位的氧化辅因子nadh形成紧密的非共价复合体fabi·nad+·triclosan，并抑制fabi酶活性。heath等人在对枯草芽孢杆菌基因组分析发现了一个基因ygaa，其编码蛋白含有tyr-(xaa)6-lys保守活性位点，与fabi同属于短链醇脱氢酶家族(sdr)。ygaa能够被三氯生可逆性抑制，但不能形成fabi蛋白所特有的稳定的三元复合物(图1)。且ygaa能恢复大肠杆菌fabi温度敏感菌株在非允许温度(42℃)生长，并对三氯生产生高抗性(大于2000μg/ml)，ygaa被重新命名为fabl，代表一类新型烯脂酰acp还原酶。利用枯草芽孢杆菌中fabl基因的特性，本专利技术通过删除表达载体中的抗生素基因，并将fabl基因插入表达载体来达到代替使用抗生素抗性基因作为筛选标记的作用。
17、基于上述技术方案，本专利技术具有以下技术效果：
18、本专利技术构建了一个无抗性标记的枯草芽孢杆菌表达载体pht254-l，通过删除抗性基因，插入枯草芽孢杆菌fabl基因作为筛选标记获得，在枯草芽孢杆菌168fabl缺失突变株中使用，功能验证结果表明，该无抗性表达系统能在枯草芽孢杆菌中工作，具有一定应用价值，能够用于食品级安全表达蛋白产品。
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1.一种枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统的构建方法，其特征在于，所述表达系统以fabL基因作为抗性标记。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建枯草芽孢杆菌fabL基因缺失突变株具体为：
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述构建以fabL基因作为抗性标记表达载体具体为：以质粒pHT254作为模板，将氨苄青霉素抗性基因Ampr替换为fabL基因，同时删除Cm抗性片段，获得表达载体pHT254-L。
5.根据权利要求1-4任一项所述的构建方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168。
6.如权利要求1-5任一项所述构建方法得到的枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统。
7.一种以fabL基因作为抗性标记表达载体，其特征在于，所述表达载体为pHT254-L。
8.如权利要求6所述枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统或权利要求7所述表达载体在安全表达蛋白产品中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌无抗生素抗性标记的表达系统的构建方法，其特征在于，所述表达系统以fabl基因作为抗性标记。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建枯草芽孢杆菌fabl基因缺失突变株具体为：
4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，所述构建以fabl基因作为抗性标记表达载体具体为：以质粒pht254作为模板，将氨苄青霉素抗性基因ampr替换为fabl基因，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王海洪，许明辉，张文彬，马金成，胡喆，余永红，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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