鉴定T细胞表位的方法及制备具有降低的免疫原性的分子的用途技术

本发明专利技术涉及鉴定在活的宿主体内引起免疫反应的Ｔ细胞表位的新方法。通过这种新方法，可产生当暴露于给定物种的免疫系统并与相关的未修饰化合物比较时没有免疫原性或至少具有降低的免疫原性的生物化合物。因此本发明专利技术也涉及通过本发明专利技术方法获得的新生物分子，尤其是蛋白质和抗体。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鉴定在活的宿主体内引起免疫反应的T细胞表位的新方法，该方法包括使用计算机辅助方法计算肽中针对MHCII类分子结合位点的潜在T细胞表位值。本专利技术还涉及用于制备当暴露于宿主，优选地暴露于人时可引起免疫原性反应的生物分子，尤其是蛋白质和抗体的方法。通过这种新方法，可制备当暴露于给定物种的免疫系统并与相关的未修饰分子比较时没有免疫原性或具有降低的免疫原性的分子，方式为在所述最初具免疫原性的分子的序列中减少或去除潜在的T细胞表位。因此，本专利技术也涉及通过本专利技术方法获得的新生物分子。
技术介绍
许多肽、多肽和蛋白质的治疗性应用由于它们在哺乳动物，尤其是人中的免疫原性而受到限制。例如，当鼠抗体施予没有被免疫抑制的患者时，大多数患者显示出对导入的外源物质的免疫反应，产生人抗鼠抗体(HAMA)(例如Schroff，R.W.等人(1985)癌研究(Cancer Res.)45879-885；Shawler，D.L.等人(1985)免疫学杂志(J.Immunol.)1351530-1535)。这将引起两个严重的后果。其一，患者的抗鼠抗体可结合治疗性抗体或免疫接合物且在治疗性抗体或免疫接合物有机会结合如肿瘤并实施其治疗功能之前将其清除。其二，患者可对鼠抗体产生变态敏感性并在将来暴露于鼠免疫球蛋白后有出现过敏性休克的危险。已使用了一些技术来解决HAMA问题，由此可在人身上使用治疗性单克隆抗体(参见例如，WO-A-89/09622，EP-A-0239400，EP-A-0438310，WO-A-91/09967)。这些重组DNA方法通常减少最终抗体构建体中的鼠的遗传信息同时增加人的遗传信息。但是，所得的＂人源化＂抗体在一些情况下仍然会使患者产生免疫反应(Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等人(1999)移植(Transplantation)681417-1420)。这些方法的一个共同方面是向治疗性抗体，通常为啮齿动物来源的治疗性抗体中引入与存在于人抗体蛋白质中的那些氨基酸残基相同的氨基酸残基，甚至是显著量的氨基酸残基序列。对抗体，该方法可归因于不同物种间抗体分子的结构(和功能的)相对高保守性。但是对潜在的治疗性肽、多肽和蛋白质，当在宿主种(如人)中不存在结构同系物时，此类方法将不适用。而且，这些方法假定人氨基酸残基序列的一般性导入将使重构抗体成为非免疫原性的。但是，正如已知的，某些短肽序列(＂T细胞表位＂)可在肽、多肽或蛋白质的细胞内降解期间释放，并接下来被主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递以启动T细胞活化。对于被MHC II类呈递的肽，T细胞的活化然后可通过直接刺激产生抗体的B细胞引起抗体反应。因此，可能希望消除肽、多肽或蛋白质中的潜在T细胞表位。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫反应。明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)51353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)3181409-1413)。关于从蛋白质中消除T细胞表位以前已有公开(参见例如WO98/52976，WO 00/34317)。在现有技术中公开的通用方法包括下列步骤(a)确定多肽或其部分的氨基酸序列；(b)使用任一方法在该蛋白质的氨基酸序列中鉴定出一个或多个潜在的T细胞表位，所述方法包括使用体外或in silico技术或生物学鉴定法确定肽与MHC分子的结合；(c)设计在已确定的潜在T细胞表位中具有一个或多个氨基酸改变的新序列变体，以实质上减少或消除T细胞表位的活性，此效果可以通过使用体外或in silico技术或生物学鉴定法测定肽与MHC分子的结合而确定。构建此类序列变体时应避免由该序列变体产生新的潜在T细胞表位，否则再对此新的潜在T细胞表位进行改变以实质性减少或消除T细胞表位的活性；(d)通过重组DNA技术构建此类序列变体，并试验所述变体，以鉴定一个或多个具有所希望特性的变体。其它利用重组MHC分子与合成肽组合形成的可与来自人或实验动物受试者外周血样本的T细胞克隆结合的可溶复合体的技术已用于本领域，这些技术也可用于表位鉴定策略。潜在的T细胞表位一般定义为具有结合MHC II类分子的能力的任何氨基酸残基序列。可测定此类潜在的T细胞表位来建立MHC结合。隐含地，术语＂T细胞表位＂为这样的表位，当其结合MHC分子时可被T细胞受体识别，并且其可以至少在原则上引起这些T细胞活化。但是，通常都知道，可以将某些被发现可以结合MHC II类分子的肽保留在蛋白质序列中，因为此类肽在最终蛋白质所施用至的生物体内具免疫耐受性。本专利技术旨在克服这样的实际问题将可溶蛋白质导入欲治疗的自体宿主中时可引发免疫反应而产生结合该可溶蛋白质的宿主抗体。例子之一为干扰素α2，尽管该蛋白质为内源产生的但部分人类患者仍产生针对它的抗体。MHC II类分子为一组在T辅助细胞的选择和活化中起中心作用的高度多态性蛋白质。人类白细胞抗原群DR(HLA-DR)为该组蛋白质的主要同种型，也是本专利技术的主要集中点。但是，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使相类似的作用，因此本专利技术同样适用于它们。MHC HLA-DR分子为同源二聚体，其中每＂一半′为由α和β链组成的异源二聚体。虽然结合沟可容纳最多9-11个氨基酸，但每一异源二聚体具有一个能结合长度在9至20个氨基酸之间的肽的配体结合结构域。配体结合结构域由α链的1至85位氨基酸和β链的1至94位氨基酸组成。最近证实DQ分子具有同源结构，预期DP家族的蛋白质亦非常相似。人类已知存在DR同种型的约70种不同的同种异型，对于DQ已知存在30种不同的同种异型且对于DP已知存在47种不同的同种异型。每一个体具有二至四个DR等位基因，两个DQ和两个DP等位基因。已解析了许多DR分子的结构，这些结构揭示了一个具有一些可结合肽的疏水残基(口袋残基)的疏水口袋的敞口肽结合沟。确定II类分子的不同同种异型的多态性促成了肽结合沟内用于结合肽的不同表面的大量多样性，并在群体水平上确保了在识别外源蛋白质并引起对病原生物体的免疫反应的能力方面有最大的灵活性。在配体结合结构域内有相当多的多态性，其中在不同地理人群和种族群体中具有不同的＂家族＂。该多态性影响肽结合结构域的结合特性，因此DR分子的不同＂家族＂将对具有不同序列特性的肽存在特异性，虽然可能存在一些重叠。该特异性决定了Th-细胞表位的识别(II类T细胞反应)，其最终负责驱动对B细胞表位的抗体反应，其中所述B细胞表位存在于Th-细胞表位所来自的同一蛋白质上。这样，个体对蛋白质的免疫反应很大程度上受T细胞表位识别的影响，其随个体的HLA-DR同种异型的肽结合特异性而改变。因此，为了在世界人群中鉴定蛋白质或肽中的T细胞表位，就可能希望考虑到尽可能多样的HLA-DR同种异型集合的结合特性，由此覆盖尽可能高的世界人口百分率。诱导免疫反应的一个主要因素是在蛋白质中存在可通本文档来自技高网...

【技术保护点】
适于在生物分子的氨基酸序列中通过一些步骤鉴定一个或多个潜在的Ｔ细胞表位肽的方法，所述步骤包括使用体外或ｉｎ　ｓｉｌｉｃｏ技术或生物学鉴定法确定所述肽与ＭＨＣ分子的结合，所述方法包括下列步骤：　　　　（ａ）选择具有已知氨基酸残基序列的肽的一个区域；　　　　（ｂ）依次从所选区域中采集具预定一致大小的并至少由三个氨基酸残基构成的重叠氨基酸残基片段；　　　　（ｃ）对每一所述采集片段计算ＭＨＣ　　Ⅱ类分子结合分值，方法为对所述采集的氨基酸残基片段中的每一疏水氨基酸残基侧链赋值求和；以及　　　　（ｄ）基于所计算的片段的ＭＨＣ　　Ⅱ类分子结合分值，鉴定出至少一个适于改变的所述片段，以改变肽的总ＭＨＣ　　Ⅱ类结合分值并且不实质性降低该肽的治疗性用途。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：FJ卡尔，G卡特，T琼斯，S威廉斯，A汉密尔顿，
申请(专利权)人：默克专利有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]