测定淋巴细胞对血液中特异性抗原的反应制造技术

病人的全血标本与病人待测定的有关抗原一同孵育。经一定时间后，以荧光染料或成色剂吸附着色，由其特征以鉴别淋巴细胞活化或淋巴母细胞转化。孵育后移置血液于一装有漂浮体的透明试管，经过离心后，此漂浮体能浓缩血液中淋巴细胞形成一淡黄色层。检测此浓缩淋巴细胞层之成色或荧光着色的状态，可证明存在有淋巴细胞活化或淋巴母细胞转化以及其浓度。荧光或成色既可定性又可利用读数仪器定量。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
此项专利技术涉及检测病人是否与某种抗原有过接触的方法，特别是针对某些疾病、感染、变态反应或其他类似的不良因素。诊断病人可能患有某些疾病时，常规的一些检查是检测病人血液中有无某些因素(如抗原)存在足以证明病人对某些疾病或有害因素有过接触。如确定病人是否与某些传染病抗原有过接触，传统的方法依靠检测病人血液中是否有直接对抗某种抗原的体液体抗体的存在。检测的一个例子包括对风疹(德国麻疹)的免疫及其他众多的病毒及细菌性抗原。检测抗体有许多方法如乳胶凝集试验，抗原被包在乳胶颗粒表面与病人血清反应后，观察有无凝集现象;酶联免疫底物分析法(ELISA)，用目测或分光光度法，观察反应后显色程度、测定放射性的放射免疫的放射免疫分析;检查在脂质体上含有(或不含有)，呈色或荧光染色和强度的脂质体技术;测量吸附在固体底物上放射强度的放射免疫吸附分析(RAST);检测抗体与固定化抗原反应的间接免疫荧光法(方法为冲洗抗原去除吸附之非特异性抗体后，加入有萤光标志的此类抗体，检测其有无萤光可见)。还有其他许多方法。检出抗体后，尚可测定其效价并鉴别其免疫球蛋白的类别(最引为注意者IgM表示急性接触;IgG表明过去有过接触;而IgE表明涉及变态反应性状态)，确定病人对某种抗原，过去有过接触。上述的所有测试都是针对一组称为B-淋巴细胞的功能而言。但是，假如某些疾病过程不出现抗体反应，上述的检查就不能检出过去有过接触的病人。有许多疾病或临床状态可能不易检出体液抗体，亦即B-淋巴细胞反应，但事实上产生有细胞免疫，即，T-淋巴细胞反应。此类T-淋巴细胞反应占主要地位的疾病及临床状态包括很多寄生虫病、结核病、沙门氏菌属病、淋病、霉菌感染，立克次体感染及尼姆氏病。Dattwyler等近期报导(新英国医学杂志，vol.319，1441，1988)相当一部分尼姆氏病病人，疾病初期接受过抗菌素治疗，不能检出尼姆氏病螺旋体的抗体，但却可测出T-淋巴细胞反应。一般有两种方法检测接触过传染原疾病病人血中有否产生T-淋巴细胞反应。一是先前有过接触者，细胞呈形态学改变。先前有过接触的T-淋巴细胞再次与此特定抗原接触时，会呈现类似母细胞之特点，例如，其细胞核增大，嗜碱细胞浆增多。生物化学改变表明细胞发生活化，如膜磷脂转换增加;RNA及蛋白合成增加;细胞内Ca++浓度改变;T-细胞生长因素inter-leukin-2表面受体表达改变;3H-胸苷的参入增加，以及其他在Chatila等近期文章中对此予以综述之现象(New England Medical Journal，Vol.320，696，1989)。过去测定T-淋巴母细胞最常用的方法和Dattwyler等人研究尼姆氏病所用之方法中，检测对某种抗原特异性T-淋巴细胞反应存在与否，都采用氚标记胸苷摄入分析方法。此法费时费事，要用放射性同位素，需要集聚相对纯净的淋巴细胞集落，并需数日完成此检测。本专利技术提出一简化的技术检测患者血液中T-淋巴细胞有否受过接触的影响。将病人的全血与被诊断怀疑的疾病的抗原一同孵育。该抗原光需匀散于经过调整pH浓度的介质中，如缓衡的盐溶液。曾受过接触的淋巴细胞，孵育后发生活化，形态上趋向细胞化，最终变成淋巴母细胞。经过一定时间的孵育后，加入一种萤光染料，如钙敏感染料fura-2的乙酰甲酯，或在血液标本中加入其他能与活化淋巴细胞或淋巴母细胞亲和的成色剂。染料经化学作用而与活化的淋巴细胞或转化之淋巴母细胞结合。所谓化学方法，如染料与增加而多余的钙离子结合。或其他方法，如以萤光标志的抗体来标志以针对转铁蛋白，Leu-23，T-细胞生长因素表面受体interleukin-2等。以染料、成色剂或萤光标志的抗体可突出鉴别血标本中任何反应性之淋巴细胞或淋巴母细胞。也应当注意到，此增强性添加物与反应性淋巴细胞结合可以在淋巴细胞变成真正的淋巴母细胞之前或之后发生，因而尚未致敏的淋巴细胞在形态上尚未完全转化之前或之后可以呈现吸引添加物而与之结合的特征。经过处理后的血液标本移置于装有漂浮体透明管予以离心。此漂浮体能集聚包括任何淋巴细胞之所有淋巴细胞于管内一小区域。此细胞集聚技术公开于StephenClarkWardlaw等申请的U.S专利号4，027，660，颁发于1977.6.7。此透明管可为毛细管或为一大的负压试管离心后，即可检测此集聚的淋巴细胞层成色或萤光着色的水平，证明淋巴细胞层中存在有淋巴母细胞。可用仪器检测此成色或萤光着色的特性，例如StephenC.Wardlaw曾以此仪器中请两项专利U.S专利号4，156，570于1978.5月颁发及4，558，947于1985.12月颁发。本专利技术的目的是为诊断接触过某种抗原的病人血中有致敏淋巴细胞，提供一改进的诊断方法与工具。本专利技术进一步的目的为提供一有所述特点之方法，其中在血液标本中加入光学可测的指示剂，以光学方法突出血标本中作出反应淋巴细胞。本专利技术的一个附带目的为提供一种有所述特点之方法，其中具有致敏的淋巴细胞为T-淋巴细胞。本专利技术的另一个目的为提供一有所述特点之方法，其中将血液标本以透明管离心集聚淋巴细胞成一层带，以便于光学分析，并且增强分析效果。本专利技术优选的实施例的下列详细的描述及附图，将使本专利技术的各个目的及优点更加明显，其中附图说明图1本专利技术的成套工具箱中三个测试管的透视图。图2显示出成层的血细胞以供光学突出检验的离心管之透视。本专利技术包括阴性与阳性两种对照。阴性对照用以说明对非特异性的刺激，T-淋巴细胞不起反应。阳性对照说明病人的淋巴细胞或者系单独地与抗原发生反应，或者包括有医生所知道的病人过去曾接触破伤风类毒素、白喉类毒素、念珠菌属或能够活化淋巴细胞的化学制剂如植物(血)凝集素、氟化铝等。病人之血标本分别放置三个反应井(容器)内，阴性对照为容器2，容器4为病人标本，阳性对照为容器6。每一容器均有封闭盖8，可经此移入血标本。染色剂可分别加入，亦可于容器之内壁预先涂上。阴性对照的容器2装有抗原的介质但不含抗原。将血标本加入此抗原介质，像病人标本那样孵育。加入成色剂或萤光。此血标本移入离心管10后离心。此离心管10内有塑性漂浮体12，其作用为限制淋巴细胞/单核细胞层带14可用的空间。然后检查此层带有否增强的光。假如有的话，那么病人血液标本光学增强的准确性就成了问题。因为血标本中淋巴细胞也可以自动发生活化。假如没有出现颜色变化，那么测试的成本光学现象是以说明血液标本中没有自发的淋巴母细胞的转化。阳性对照容器6为血标本混合上述任何一种的传染性抗原，这些抗是在大多数正常病人中能使淋巴细胞活化，孵育后阳性混合物如图2所示，加入成色剂或萤光后离心。染色剂与孵育血液标本中酵母诱发的淋巴母细胞有亲和作用。离心后检查此细胞带14有否淋巴母细胞的光学增强。若有，则说明这特检测的方法适用于测试病人的血液是否受感，假若没有反应则说明这病人不适用于这样的检查。医生要拟定报告以说明病人对此致病抗原不出现阳性反应的原因，也就是说对此致病抗原的阴性反应并不是以否定病人过去有过接触和对抗原的致敏。自病人对阳性对照的阳性反应和对阴性对照的阴性反应可以看到此种检测的实用性。自下列几方面说明本专利技术有别于过去检测的方法1.不同于只能检测单个细胞萤光信号的细胞计数器，本专利技术利用淋巴细胞团全部集落本文档来自技高网...

【技术保护点】
判别病人过去接触过某种抗原血液中淋巴细胞致敏的血液检测方法，此方法包括下述步骤：ａ）将病人的血液标本与要检测的抗原予以混合成混合物；ｂ）在混合物中加入一光学可测出指示剂以与血中经抗原反应后的淋巴细胞发生亲和，从而可以光学方法突出显示 该有过反应的淋巴细胞。ｃ）将部分混合物置于透明管中离心，使淋巴细胞／单核细胞于管内集聚成一细胞层带；ｄ）判定离心管淋巴细胞／单核细胞层带中淋巴细胞及／或淋巴母细胞有无光学增强，从而判定病人对被检测的抗原过去有否接触，而使患者一部分淋 巴细胞因而致敏。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特A莱维，斯坦芬C沃尔德拉，
申请(专利权)人：罗伯特A莱维，斯坦芬C沃尔德拉，
类型：发明
国别省市：US[美国]