酶发光测定方法技术

测定样品中酶活性的方法，包括在反应介质中将可能含有酶的样品和能与酶反应形成产物的标记底物合并；使酶与底物间发生反应，在酶的存在下形成产物；在使反应发生前或发生后，将能与标记产物或标记底物，但不是两者，特异结合的受体并入反应介质，形成复合物；和测定复合物中或反应介质中未复合的可检测标记物的存在或量，其中可检测标记物是生物发光蛋白。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测酶活性的方法，特别涉及检测生物来源的样品中酶活性水平的测定方法。有许多种测定方法可用于检测具有生物学重要性(无论是显示正常状态还是表现为病态)的特定分子的浓度和活性。在这些待测分子中包括酶，酶是典型的生物催化剂。虽然酶可通过仅检测该分子是否存在的传统方法测定，但这样的测定不能用于测定酶活性水平。例如，一种依赖于酶上某一特定抗原决定簇存在的检测该酶的免疫测定法，只要该抗原决定簇不改变，即表明有一定量的酶存在。如果该酶存在，但酶活性，例如由于与修饰过的底物的不可逆结合或存在于酶的活性中心的金属离子所产生的抑制作用而改变，则即使可正确地示出所存在的酶量，所示出的酶活性水平也是不准确的。相对于酶量测定，目前已有测定酶活性的技术，由于酶是使底物转化为产物的催化分子，所以这样的测定一般包括测定底物的量随时间的变化。其中一种方法是使用一种无色，但当与酶作用时可形成有色产物的底物。已发展了许多这样的反应，在分析反应如酶联免疫吸附测定(ELISA)中酶本身用作标记物。过氧化物酶常常用作这种类型的标记物，因此便于用相同的底物和反应产物测定过氧化物酶的活性。然而，这样的测定方法只有在可经历颜色变化的适宜底物可得到的情况下才能使用，因而不是通常适用的方法。对于大多数类型的酶来说，不能使用显色测定法。动物细胞糖基转移酶就是这类酶的实例。这些酶通过使一种糖核苷酸供体的糖部分转移到一条待增长的多糖或寡糖链的特定羟基上而在糖结合物上催化形成糖苷键。动物细胞中代表性糖结合物包括糖蛋白，糖脂和葡糖氨基聚糖。不同于核酸和蛋白质，在糖结合物的合成中不涉及模板，因此，其合成的控制及其结构的确限度取决于糖基转移酶的表达和高度特异性。动物细胞中不同的糖基转移酶的总数是未知的，然而，基于所观察到的糖结合物结构的变化，看来存在着数百种这样的酶。此外，不同的糖基转移酶可利用相同的糖核苷酸和相似的受体生成不同的产物。如下所述，糖基转移酶的这些特征当有一种以上的酶存在于组织样品中时，在检测它们的比活性时出现一些独有的问题。目前，大多数测定糖基转移酶的方法都采用放射性同位素并包括从糖核苷酸掺加到产物糖苷中的放射性的测定。各种非放射性同位素糖苷转移酶测定法已得到发展，但这些测定法的灵敏度并非明显高于使用现存的放射性同位素测定法所获得的灵敏度。虽然已知测定法的灵敏度相对于许多其它类型的酶测定法来说可能是高的，但对于许多糖基转移酶来说它又低得无法接受，糖基转移酶的活性可低至1pmol/小时/mg细胞蛋白质。本专利技术人之一的实验室已报导了一种测定糖基转移酶的方法。在cummings等人，J.Biol.Chem.(1988)5511-519中报导了一种用外源凝集素俘获UDP-半乳糖;β-D-半乳糖基-α-1，3-半乳糖基转移酶的特异酶产物的测定法。将放射性标记的半乳糖从供体分子UDP-GlcNAc(尿苷-5′-二磷酸-N-乙酰半乳糖胺)转移到一种糖蛋白受体分子的末端，并用外源凝集素衍生的亲合柱(柱上结合酶反应产物而不是反应物)从溶液中分离出该产物。然而，这种测定法严格地受测定放射性标记所需时间和难度限制。几年来，为了在免疫测定中不再使用放射性同位素而代之以其它类型的可检测标记物，已做过多种尝试。某些酶已被成功地用作许多免疫测定的标记物，即使这些酶的灵敏度一般低于同位素标记物的灵敏度。这类测定法的典型实例是其中用酶标记免疫球蛋白的测定法，通常称之为酶免疫测定法(EIA)。在这类测定法中也可用酶标记分析物。有关EIA的详细描述见WilfrldR.Butt编辑的“PracticalImmunoassay”第3章，“ClinicalandBiochemicalAssays”14卷(MarcelDekker，Inc.，1984)。除酶之外，化学发光化合物和生物发光化合物也已被用作免疫测定的非放射性标记物，代替同位素。这类测定法被称为发光免疫测定法(LIA)或免疫化学发光计量测定法(ICMA)。这些标记物通常已证明在灵敏度方面是与同位素等同的，但经常受到与标示物的蛋白组分(典型的是荧光素酶)的非特异性结合相关的问题的阻碍。有关这些测定法的更详尽的描述见“PracticalImmunoassay”第5章，op.cit.和PatelandCormier，AnalyticalApplicationsofBioluminescenceandChemiluminescence，273-276页，AcademicPress，Inc.，1984。然而，以前采用的测定法没有一种能提供适于酶活性测定的通用性，高灵敏度，并消除本底干扰。因此，尚需要可在样品中直接测定相对于酶浓度的酶活性的测定法和普遍适用于各种酶的直接方法。因此，本专利技术的目的在于提供一种特异地，快速地和简便地测定尤其是生物来源的样品的酶活性的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种测定酶活性的方法，该方法可用于各种酶而不需技术上的较大变化。通过提供一种检测样品中酶活性的存在或水平的方法已达到了本专利技术的这些和其它目的，这些目的通过下述将会更加明显，所述方法包括在反应介质中将(1)怀疑含有所述酶的样品和(2)能与所述酶反应生成标记产物的所述酶的标记底物合并，其中所述标记物包括一种生物发光蛋白或能被转化为生物发光蛋白的标记物;使所述酶和所述底物在一定时间内发生反应，从而在所述酶存在下生成所述产物;将能与所述标记产物或所述标记底物(但不是两种同时)特异性结合以形成复合物的受体与反应介质合并;和通过在所述生物发光蛋白的控制下引发光发射来检测在所述复合物中或在不与受体反应的非复合、标记组分中标记物的存在或量。参照下面具体实施方案的详述，并结合考虑构成本说明书一部分的附图，可更好地理解本专利技术。附图说明图1是本专利技术第一个实施方案的图解。图2是本专利技术第二个实施方案的图解。图3是本专利技术第3个实施方案的图解。图4是本专利技术第4个实施方案的图解。图5是用于一种特殊测定的本专利技术实施方案的图解。本专利技术提供一种检测酶活性的方法，该方法适用于任何经与一种结合物(受体)结合而产生一种能与酶的底物区分开的产物的酶。使用一种能俘获产物而不与底物适度结合(反之亦然)的受体，可容易地区分并定量所形成的产物或参加反应的底物的量。本专利技术的方法也需要一种生物发光蛋白，特别是能结合荧光素酶分子并通过一种外加引发物所引发的光蛋白，作为底物和/或产物的可检测标记物。另外，该标记物可被转化为生物发光蛋白标记物，例如通过俘获蛋白标记物与连接于底物或产物上的生物素分子的抗生物素蛋白复合物转化。通过使用生物发光蛋白作为标记物，可产生各种优点，如下文详述。设计的方法最初是使用外源凝集素作为受体，碳水化合物作为底物和产物用于测定糖基转移酶，因为这些酶的天然存在量低，活性很低，给酶的测定带来困难。由于证明了本测定法可用于这种困难的测定，所以它可被应用于其它体系。其它天然特异结合化合物如激素受体可使得本专利技术能广泛用于各种酶。另外，通过杂交瘤生产的具有高度特异性的单克隆抗体也可使得这些技术能应用于许多不同的没有天然受体可供的酶产物。该方法的范围相当宽，如下所示。按标准技术收集怀疑含有酶的样品，与具有可检测标记的酶的底物或能在测定的后一步骤被标记的底物合并。该底物也能与酶反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
测定样品中酶活性的方法，其特征在于该方法包括：ａ．在反应介质中合并（１）可能含有所述酶的样品和（２）能与所述酶反应提供标记产物的酶的标记底物；ｂ．使反应在所述反应介质中在所述酶和所述底物间进行，在所述酶的存在下生成所述产物； ｃ．在使所述反应发生前或发生后，使所述反应介质与一种能与所述产物或所述底物，但不是两者，特异结合的受体合并，形成复合物；ｄ．测定在所述复合物中或反应介质中未配合的标记物的存在或量，其中所述标记物含有生物发光蛋白。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：理查德D库明司，米尔顿J考米尔，
申请(专利权)人：佐治亚州大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]