用环介导等温扩增方法检测河流弧菌的试剂盒及方法技术

涉及一种用环介导等温扩增方法检测河流弧菌的试剂盒及方法，试剂盒包括（１）ＬＡＭＰ反应液Ａ，其中上游内引物为：ｇｔｇｃｃｔｔｃｃａｃａｔｃａｃｃａｇｇａｔｔｔｔｇｇｔｇａｃｃｔｇａｔｃｇｔｃａｃａｃ；下游内引物为：ｔｃｃｇｃａｇｔｇａｃｔｇｇｔｃｇａｇｔｃｔｔｔｔｇａａｇｃｃｔｔｇｇｃｔｇａｃｔｔｇｇ；上游外引物为：ｔｃｃｔｇｃａａｇａｃｇａａａｔｇｇｃ；下游外引物为：ｃｔｃａｃｔａａａｃｇｔｃｇｇｔｇｃｔｃ；（２）ＢｓｔＤＮＡ聚合酶Ｂ；（３）显色剂Ｃ；检测方法包括：细菌ＤＮＡ的提取、河流弧菌的环介导等温扩增、显色检测；优点是快速、特异性强、灵敏度高，且成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用环介导等温扩增方法检测河流弧菌的试剂盒，进一步涉及一种使用该种试剂盒快速检测河流弧菌的方法。
技术介绍
河流弧菌(Vibrio fluvialis)是广泛分布在海洋里的一种革兰氏阴性致病菌。该菌已引起包括海水养殖贝类(鲍)和牙鲆等多种水产动物的败血症、脓疱病等疾病，给水产养殖业造成了严重的经济损失。该菌不仅可以感染水产动物，还可以通过食物传播感染人类，主要是因进食未煮熟的污染河流弧菌的海产品而导致流行性腹泻，其症状与由霍乱弧菌引起的霍乱极为相似，因此，河流弧菌现在被认为是重要的人类食源性疾病和水产养殖动物疾病病原。以往检测河流弧菌主要有三种办法1.生化鉴定法，该法费时，操作繁琐，不能满足病害防治的需要；2.荧光抗体检测法，虽然该法较灵敏，但耗时也较长，且需要昂贵的荧光检测设备；3.聚合酶链式反应法(PCR法)，该法较前两种方法快速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未有的报道。专利技术的内容本专利技术的目的是提供一种快速、特异性强、灵敏度高且成本低的用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法检测河流弧菌的试剂盒，并提供一种使用该试剂盒快速检测河流弧菌的方法，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。本专利技术的主要原理为(1)特殊设计一组可识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先与靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成的模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始的茎环DNA为模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的有两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。本专利技术涉及的一种用环介导等温扩增方法检测河流弧菌的试剂盒，其试剂包括 (1)环介导等温扩增(LAMP)反应液A含有10×Thermopol反应缓冲液、300-500uM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、2-4mM硫酸镁(MgSO4)、0.8-1.2uM上游内引物(flu-FIP)、0.8-1.2uM下游内引物(flu-BIP)、0.2-0.3uM上游外引物(flu-F3)、0.2-0.3uM下游外引物(flu-B3)和1-1.5M甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mM氯化钾(KCl)、100mM硫酸铵((NH4)2SO4)、20mM硫酸镁(MgSO4)和1％曲拉通X-100(Triton X-100)；上游内引物(flu-FIP)为gtgccttccacatcaccaggattttggtgacctgatcgtcacac；下游内引物(flu-BIP)为tccgcagtgactggtcgagtcttttgaagccttggctgacttgg；上游外引物(flu-F3)为 tcctgcaagacgaaatggc；下游外引物(flu-B3)为 ctcactaaacgtcggtgctc；(2)Bst DNA聚合酶B每微升含8个活性单位(8U/uL)；(3)显色剂C为10％的荧光染料SYBR GREEN I。上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液A每管23uL的最佳组成为2.5uL 10×Thermopol反应缓冲液、1.0uL 10mM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游内引物(flu-FIP)、1.0uL 20uM下游内引物(flu-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(flu-F3)、0.25uL20uM下游外引物(flu-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜碱和4uL ddH2O(灭菌双蒸水)。使用上述环介导等温扩增方法检测河流弧菌的试剂盒检测河流弧菌的方法，依次包括下列步骤(1)细菌DNA的提取A.取1.0-1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，弃上清液；B.加入1.0-1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，弃上清液；C.加入100-150 uL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴10-15分钟；D.用台式离心机10000-12000转/分离心5-10分钟，取上清液至一个新的1.5mL离心管中，即为待检模板DNA；(2)河流弧菌的环介导等温扩增A.在装有23uLLAMP反应液A的反应管中加入和1uL待检模板DNA，于恒温金属浴上95℃放置3-5分钟，立即置于冰上1-3分钟；B.在反应管中加入1uL下游内引物(para-BIP)DNA聚合酶B；C.于恒温金属浴上60-65℃放置45-90分钟； D.将金属浴调到80-95℃中止反应，3-5分钟后取出；(3)显色检测在反应管中加入1uL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，如果颜色为黄色，说明待检细菌不是河流弧菌，如颜色变为绿色，则说明样品为河流弧菌。本专利技术的优点本专利技术建立了河流弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，本试剂盒根据河流弧菌的基因保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，以保证检测不同来源河流弧菌株的可靠性。本专利技术采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速。可用于河流弧菌的检测，特别适合于基层医疗机构以及养殖现场应用。具体实施例方式下列实例是进一步对本专利技术的说明，不应该当作对本专利技术的限制。按下列配方制作河流弧菌的环介导等温扩增检测试剂盒(1)LAMP反应液A2.5uL10×Thermopol反应缓冲液、1.0uL 10mM dNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1.0uL 20uM上游内引物(flu-FIP)、1.0uL 20uM下游内引物(flu-BIP)、0.25uL 20uM上游外引物(flu-F3)、0.25uL 20uM下游外引物(flu-B3)、0.5uL 100mM MgSO4、12.5uL 2M甜菜碱和4uL ddH2O(灭菌双蒸水)。(2)Bst DNA聚合酶B浓度为8U/uL。(3)显色剂C10％的SYBR GREEN I。按照以下程序进行检测(1)细菌DNA的提取A.取1.0mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离心机12000转/分离心5分钟，弃上清液；B.加入1.0mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心5分钟，弃上清液；C.加入100uL灭菌双蒸水，混匀，100℃沸水浴10分钟；D.用台式离心机12000转/分离心10分钟，取上清液至一个新的1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用环介导等温扩增方法检测副溶血弧菌的试剂盒，其试剂包括：（１）环介导等温扩增反应液Ａ：含有１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液、３００－５００ｕＭｄＮＴＰ、２－４ｍＭ硫酸镁、０．８－１．２ｕＭ上游内引物、０．８－１．２ ｕＭ下游内引物、０．２－０．３ｕＭ上游外引物、０．２－０．３ｕＭ下游外引物和１－１．５Ｍ甜菜碱；其中１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反应缓冲液含有２００ｍＭｐＨ８．８的三羟基甲基氨基甲烷－盐酸、１００ｍＭ氯化钾、１００ｍＭ硫酸铵、２０ｍ Ｍ硫酸镁和１％曲拉通Ｘ－１００；上游内引物为：ｇｔｇｃｃｔｔｃｃａｃａｔｃａｃｃａｇｇａｔｔｔｔｇｇｔｇａｃｃｔｇａｔｃｇｔｃａｃａｃ；下游内引物为：ｔｃｃｇｃａｇｔｇａｃｔｇｇｔｃｇａｇｔｃｔｔｔｔｇａａｇｃｃｔｔｇｇｃｔ ｇａｃｔｔｇｇ；上游外引物为：ｔｃｃｔｇｃａａｇａｃｇａａａｔｇｇｃ；下游外引物为：ｃｔｃａｃｔａａａｃｇｔｃｇｇｔｇｃｔｃ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：任春华，胡超群，罗鹏，王青柏，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]