一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法技术

本发明专利技术公开了一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法，包括以下步骤：(1)设计针对MGE序列的sgRNA，将表达sgRNA和Cas9的pMBLcas9‑sgRNA质粒转移到目标细菌中，筛选阳性接合子；(2)培养阳性接合子，产生Cas9/sgRNA复合物消除MGE；(3)将步骤(2)的细菌培养物划线在不含抗生素的固体培养基上，以获得单菌落；(4)挑选单菌落，检测MGE的消除情况，获得MGE敲除菌株。该方法不仅推动细菌中MGEs的研究，而且对于快速生成工业生产等商业用途菌株具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物领域，具体涉及一种联合cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法。

技术介绍

1、可移动遗传元件(mobile genetic elements，mges)，包括噬菌体、质粒、转座子、整合性转移元件、和毒力岛和抗性岛等基因岛，在细菌基因组中广泛存在。在生态系统中，这些mges携带着与增强宿主适应性相关的基因，如抗生素抗性基因、毒力基因等，促进着细菌宿主的环境适应性和进化。然而，在生物
，一些mges在工业生产菌株中的存在可能导致问题。例如，原噬菌体可能发生裂解-溶解转换，在宿主细胞内复制增殖并释放子代噬菌体，最终导致细菌裂解，引发发酵过程失控，同时也会对发酵产品质量造成不利影响；毒力岛上毒素蛋白的表达可能导致细菌培养物的污染，质粒携带的抗生素抗性基因的表达会造成抗生素抗性基因传播，这在生物技术和环境中构成严重问题。因此，工业生产菌株在使用前需要尽量清除原噬菌体、毒力岛和抗性岛等不利于生产的mges。在科学研究中，为了更清晰地阐明这些mges的作用，也需要建立完善的mges敲除方法。

2、mges以多种形式存在于细本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述设计针对MGE序列的sgRNA为设计针对MGE序列的20-nt的碱基互补配对区域的特异sgRNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达sgRNA和Cas9的pMBLcas9-sgRNA质粒的构建方法包括如下步骤：设计引物引入与sgRNA互补配对的碱基序列，用该引物以pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段，然后以该PCR产物为模板，用sg-F、sg-R引物扩增获得581bp的PCR...

【技术特征摘要】

1.一种联合cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述设计针对mge序列的sgrna为设计针对mge序列的20-nt的碱基互补配对区域的特异sgrna。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达sgrna和cas9的pmblcas9-sgrna质粒的构建方法包括如下步骤：设计引物引入与sgrna互补配对的碱基序列，用该引物以pgrna-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的pcr片段，然后以该pcr产物为模板，用sg-f、sg-r引物扩增获得581bp的pcr片段，将该片段连接至pmblcas9质粒，构建表达sgrna和cas9的质粒pmblcas9-sgrna，所述sg-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述sg-r的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将阳性接合子在含有氯霉素和l-阿拉伯糖的培养基中培养后，再按体积比例1/1000转接培养液至新鲜的含有氯霉素和l-阿拉伯糖的培养基中再培...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓雪，王鹏霞，杜晓飞，赵逸，王伟权，蔡彤璇，汤开浩，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：