肝癌细胞特异性内在化短肽及其体外筛选和鉴定制造技术

本发明专利技术涉及肝癌细胞特异性内在化的短肽以及其体外筛选和鉴定，属肿瘤细胞特异性内在化短肽的筛选和鉴定的技术领域。以肝癌细胞ＢＥＬ－７４０４作为筛选靶细胞，对噬菌体展示随机１２肽库进行亲和淘选。经３轮淘选，随机挑选２０个噬菌斑进行了扩增和测序，推导随机多肽的氨基酸序列。经细胞ＥＬＩＳＡ、免疫荧光、流式细胞术等方法进一步鉴定噬菌体克隆与肝癌细胞的结合力以及内在化的效果。通过对阳性克隆的测序和序列比较分析，得到４种不同的序列，都有良好的与肝癌细胞的结合力；筛选到的单克隆可内在化进入细胞。通过对噬菌体随机肽库的筛选，得到可与肝癌细胞ＢＥＬ－７４０４结合和可内在化的噬菌体短肽，为肝癌的治疗提供进一步的理论基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肝癌细胞特异性内在化的短肽及其体外筛选和鉴定，属肿瘤细胞特异性内在化短肽的筛选和鉴定的

技术介绍
肝癌因其极高的死亡率严重威胁着人类的健康。近年来，随着对肿瘤生物学和细胞表面受体研究的深入，导向治疗显示出良好的治疗效果，并逐步发展成为一个重要的肿瘤治疗领域。导向治疗指利用特异性能作用于肿瘤组织或器官的导向分子作为药物载体，将药物导向肿瘤，有效地提高药物导向的特异性，实现治疗的针对性和安全性。目前普遍采用的导向分子主要是单克隆抗体及其片段，近年来由抗体相关分子构建的导向治疗药物取得了巨大的成功。然而由于单抗分子所具有的分子量大、免疫原性高、肿瘤浸润能力差等缺点，大大阻碍了相关治疗药物在临床治疗领域的发展。针对单抗分子具有上述这些缺点，越来越多的研究者将目光投向小分子的多肽类靶向分子，由于多肽分子具有分子量小的特点，从根本上解决了免疫原性高和肿瘤浸润能力差的问题，成为目前发展的热点。噬菌体展示技术(phage display technique)是利用基因操作手段，将编码选定多肽的外源DNA片段与丝状噬菌体的外壳蛋白基因进行适当的重组，使重组后的外源DNA片段随同噬菌体的外壳蛋白基因一起被转录和翻译，使外源DNA编码的多肽与噬菌体外壳蛋白形成的融合蛋白表达展示在病毒的表面。该外源肽仍能保留其抗原特异性和生物活性，且融合表达不影响噬菌体的繁殖，因此可对该外源多肽进行体外筛选。传统的筛选技术通常直接针对肿瘤细胞特异性蛋白或者肿瘤细胞表面进行筛选，所得到的导向分子也是与肿瘤细胞表面相结合，虽然解决了局部提高治疗药物浓度的作用，但是并不能有效地提高治疗药物对肿瘤细胞的进入问题，而大部分药物都需要进入到细胞内部以后才能够最好地发挥作用。因此对具有内在化能力的特异性结合肽的筛选具有十分重要的意义。用噬菌体展示库筛选内在化抗体，就是通过噬菌体展示库与靶细胞相互作用一段时间，启动内在化途径，通过体外筛选直接筛选出能与细胞表面受体结合并内在化的噬菌体表达短肽。本专利技术通过体外筛选技术筛选到4种与肝癌细胞BEL-7404特异性结合的噬菌体短肽，并通过有效的方法对噬菌体短肽进行鉴定，鉴定到短肽可以内在化。因此，在肝癌的治疗和诊断中有着潜在的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是公开4种肝癌细胞特异性内在化短肽，其特征在于，所述的短肽的氨基酸结构具有如下序列1.DLNYFTLSSKRE；2.DLNYLTLSSKRE；3.DLNYHARSYKRE；4.NLKLLDSQDWDG。此类短肽不仅仅具有特异性结合肝癌细胞的能力，还可以通过相关受体的介导有效地进入到细胞内部，可以大大提高肿瘤治疗药物对肝癌的特异性杀伤作用。本专利技术的另一个目的是推出一种体外筛选肝癌细胞特异性内在化短肽的方法。用该法筛选到的内在化短肽可将药物定向运输到肝癌细胞中，更好地发挥药物的药理作用。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案。通过噬菌体表面展示肽库与靶细胞的相互作用，启动内在化途径，体外筛选能与细胞表面受体结合的内在化短肽。现详细说明本专利技术的技术方案。一种体外筛选肝癌细胞特异性内在化短肽的方法，其特征在于一、所需材料 噬菌体表面展示肽库随机12肽噬菌体展示文库(Ph.D.12TMPhage Display PeptideLibrary Kit)购自美国New England Biolabs公司，其中噬菌体的滴度为1.5×1013pfu/ml，多样性为2.7×109，宿主菌为E.coli ER2738；细胞人肝癌细胞BEL-7404和正常人肝细胞HL-7702购自上海中科院细胞库；关键试剂枯草杆菌蛋白酶和氯喹购自FLUKA公司；PBS每升溶液中含130mM NaCl，7mM Na2HPO4-12H2O，3mMNaH2PO4，pH 7.5；TBS每升溶液中含50mM Tris，150mM NaCl，pH 7.5；细胞裂解液2％w/v的去氧胆酸钠，10mMTris-HCl，2mM EDTA，pH 8.0；蛋白酶抑制剂每毫升中含有PMSF 100mM、Aprotinin 15uM、Leupeptin 100μM、Bestatin 100μM、Pepstain A 100μM、E-64 80μM溶解在DMSO中；二、内在化短肽的体外筛选，操作步骤第一步 将10μl上述的肽库加入含100μM氯喹和10％CBS2ml的1640培养基中，室温孵育1小时；第二步向体外培养至80％聚合度的人肝癌细胞BEL-7404的培养瓶内加入2ml含100μM氯喹和10％CBS的1640培养基，37℃孵育30分钟；第三步将经第一步处理的2ml肽库加入经第二步处理的培养瓶内，37℃孵育2小时；第四步将所述的培养瓶放冰上5分钟，后续的操作都在4℃下进行，用2ml含Mg2+和Ca2+的PBS清洗细胞2次，再用2ml PBS清洗细胞6次，每次都是3分钟，再用TBST清洗细胞1～4次，TBST的配方为TBS中加入0.05％v/vTween-20； 第五步加入含有枯草杆菌蛋白酶3mg/ml的TBS与表面结合有噬菌体的肿瘤细胞孵育45分钟，降解与细胞表面结合的噬菌体，用含有0.1％的乙二胺四乙酸二钠溶液使细胞重悬，1500rpm离心10分钟，离心收集得到单细胞悬液，最后加入5ml的含有蛋白酶抑制剂的PBS孵育15分钟，终止酶的活性；第六步对经第五步处理后的溶液进行1500rpm离心，时间为10分钟，收集细胞，用PBS清洗，重悬于200μl的细胞裂解液中，振荡离心管，室温孵育30分钟，加入50μM的MgCl2到混合物中，中和裂解缓冲液中的EDTA并帮助侵染，回收后的溶液留5μl测滴度，200μl保存，其余的噬菌体侵染大肠杆菌扩增并测滴度；第七步为除去能够和正常肝细胞结合的噬菌体，选择聚合度达到80％的生长状态良好的HL-7702，用PBS清洗3次，洗掉未贴壁的细胞，加入第一次筛选的噬菌体肽10μl，内含噬菌体约1011个，温育1小时，吸取上清，所得到的未与正常肝细胞结合的噬菌体就是所需的肝癌细胞特异性内在化噬菌体，放入4℃冰箱保存，测定噬菌体的滴度，至此，第一轮体外筛选完成；整个筛选过程共包括三轮，在第二轮开始时加入第一轮筛选后扩增的噬菌体，而第三轮采用的是第二轮筛选后扩增的噬菌体，第三轮筛选后的噬菌体含有肝癌细胞特异性内在化短肽，从第二轮和第三轮筛选后测滴度的平板上各挑选了20个蓝斑进行测序并鉴定。本专利技术的另一个目的是提供一种鉴定肝癌细胞特异性内在化短肽的方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案。一种鉴定肝癌细胞特异性内在化短肽的方法，其特征在于一、所需材料上述的体外筛选得到的噬菌体单克隆，宿主菌为E.coli ER2738；细胞人肝癌细胞BEL-7404、BEL-7402、正常人肝细胞HL-7702、正常人胚肾细胞293购自上海中科院细胞库； 关键试剂兔抗噬菌体M13抗血清由澳大利亚CSIRO动物健康研究所(Australia Animal Health Laboratory)王林发研究员惠赠；HRP-兔抗M13抗体购自Sigma公司；FITC标记的羊抗兔IgG购自上海华美公司；枯草杆菌蛋白酶和氯喹购自FLUKA公司；PBST05PBS中加入0.05％本文档来自技高网...

【技术保护点】
４种肝癌细胞特异性内在化短肽，其特征在于，所述的短肽的氨基酸结构具有如下序列：１．ＤＬＮＹＦＴＬＳＳＫＲＥ；２．ＤＬＮＹＬＴＬＳＳＫＲＥ；３．ＤＬＮＹＨＡＲＳＹＫＲＥ；４．ＮＬＫＬＬＤＳＱＤＷＤＧ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钱旻，杜冰，李晶，汪磊，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]