一种新型检测评估肿瘤病人的试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及一种检测、评估肿瘤病人的试剂盒和新方法，为一种非侵入性生物标志蛋白的体外检测方法。本方法用抗体吸附表面基质及质谱法进行鉴别检测发现一种新型变异的补体蛋白Ｃ３ａ。变异的补体蛋白Ｃ３ａ或８９３８±１５Ｄａ峰值可用于肿瘤病人的检测及评估。本发明专利技术提供方法能够同时检测三种不同肿瘤的病人，其灵敏度为８４％，特异性为１００％。通过８９３８±１５Ｄａ峰值或被抗体吸附表面基质上捕获的变异的补体蛋白Ｃ３ａ，用标准化质控血清控制下的定量性质谱分析来检测，可以应用到已经脱离人体的体液中的生物标志组合的检测方法或试剂盒开发。本方法准确、方便且快捷。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种非侵入性检测、评估肿瘤病人试剂盒的新方法，其特征是采用质谱法 对样品中已被磁珠或抗体捕获的变异的补体蛋白C3a进行精确地鉴别、检测的方法。本 专利技术提供的方法能够检测三种不同肿瘤的病人，其灵敏度为84%,特异性为100%。
技术介绍
随着人类基因组计划的实施和完成,科学家们提出了后基因组(post-genome)计划的 概念，研究要点转移到功能基肉组学上，而生物功能主要体现物质是蛋白质。1994年， 澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出蛋白质组(proteome)的概念， 指的是"一种基肉组所表达的全部蛋白质"，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部 蛋白质。对于蛋白质组的研究是功能基丙组学研究的核心，称为蛋白质组学(proteomics)。 蛋白质组学被认为是后基丙组研究中最主要的部分。与基肉组相比，蛋白质组的组成更复 杂，功能更活跃，应用前景更广泛。蛋白质组学从细胞整体水平进行蛋白质属性的研究， 如表达水平、翻译后修饰及相互作用等，并由此获得对于疾病过程、细胞生理生化特征和 调控M络的广泛完整的认识。所以，蛋白质组学技术正在逐步成为生物学、医学及制药学 等的重要研究手段。不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功 能。因此，鉴定人体内表达的蛋白质的区别，可用于体外疾病样本诊断及筛查，并最终用 于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细 胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的 方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行化学结构及蛋白质序列鉴定分析。 用抗体及质谱联合可克服这一技术缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种在生物样品中检测正常人与某种或多种疾病在离体血液中 生物标志的试剂盒和方法。该方法为疾病的早期检测提供了新的途径，并为进一步发现新 的变异的生物标志提供了基础。本专利技术涉及一种非侵入性检测、评估肿瘤病人的新方法，其特征是采用质谱法对样品 中已被WCX/SAX磁珠或抗体捕获的变异的补体蛋白C3a进行精确地鉴别、检测的方法。本专利技术中的变异的补体蛋白C3a生物标志是利用一台质谱仪来发现的。该设备的质 量精确度约为+/_0. 1%。变异的补体蛋白C3a生物标志物首先能够被具有能与生物标志物结合的抗体或磁珠 基质WCX/SAX吸附表面捕获，非吸附物能从基质上洗脱，吸附到底基的生物标志物在飞 行质谱仪中被检测。生物标志物通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个 离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子 信息转换为质荷比。定量性控制及质谱激光能量调控每次测试前，用质谱的标准化质控 血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰4091. 1Da或6634. 0 Da强度调至50%质谱 信号强度的最大值。生物标志物的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，生物标志 物的数量与质量都可以被检测出来。飞行质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子 化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干 扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。软件中数据处理主要包 括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而 减轻高频噪音。通过对生物标志物的吸附和检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分 析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的标记物的数量，并显示信号的强度和确 定被检测的每个生物标志物的分子量。数据分析还能包括一系列的确定生物标志物的信 号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰 值的高度，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生 的不重要的^^扰，这可以设置调零。计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形 式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分 子量的生物标志物更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的生 物标记物和那些高于或低于校准样本的生物标志物。分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选 择，软件是可用的，它可自动检测峰。 一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于 一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本 聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。对生物标志的检测需要将一个样本放基质的一个吸附点上，接着进行清洗。向吸附点 上加入SINAPINIC酸等并让其干燥。而后，用质谱测定法对基质进行分析，而一个显示 了蛋白质分子的遗留物图将生成，这张图是在蛋白质分子的质量-电荷比的基础上，以彼 此分开的峰图的形式显示出来的。因为本项专利技术中的生物标记是通过质量和抗体来标识的，因而它们可通过质谱测定法 进行检测而直接知道它们特定的身份。这种方法比抗体为基础的ELISA及免疫荧光法更准 确。然而，如果有必要，这些生物标志也可通过，比如，确定多肽的氨基酸序列来进行鉴 别。例如， 一个生物标志能用许多酶描绘出来，例如V8蛋白酶(V8 protease)或胰蛋白 酶，而且消化片段(digestion fragments)的分子量可被用来在数据库中搜索序列，这 些序列与由多种酶生成的消化片断的分子量相吻合。或者，如果此生物标志不是已知数据 库中的蛋白质分子，在生物标志的N极氨基酸序列(N-terminal Amino Acid Sequence) 的基础上，可使用降解探针，而后，这些探针会被用来描绘由探测到了生物标志的样本所 生成的基闲组或cDNA库。最后，蛋白质生物标志可用蛋白质梯状排序法(protein ladder sequencing)进行排序。通过将分子碎成碎片并将碎片用酶解作用或其他可按顺序从碎片 末端除去一个单个氨基酸分子的方法进行处理后，可生成蛋白质梯度(protein ladders)。 然后，用质谱对此梯度进行分析。阶梯状碎片(ladder fragments)在质量上的差异可鉴 别出从分子末端被除去的氨基酸。特异性是指某一物质或某种疾病的专一属性，它是代表某种物质或某种疾病的特征。 通过某些特征可以识别某种物质或某种疾病，从而把它和其他物质或疾病区分开来。对专 有特征的识别往往依赖于特殊的检测方法，例如要了解某种疾病是否存在有特异性抗原就 要用有关特异性抗体来检测。自蛋白质组学研究有新发展以来，这种传统意义上特异性检 测和界定方法有了很大的突破。如一个蛋白质不同片段变异是不同类型肿瘤的标志。根据 基因到蛋白质表达的复杂过程， 一种特异性基闲的产物一蛋白质必定有相关多组分蛋白质 的表达。通过对这些不同组分的检测形成一个综合模式图(蛋白指纹图谱)，将这种图谱(如 某种肿瘤)与其他图谱(如正常人或其他疾病)相比较，进而本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术涉及一种检测、评估肿瘤病人的试剂盒和新方法，其特征是采用质谱法对样品中已被基质捕获的变异的补体蛋白Ｃ３ａ生物标志进行精确地鉴别、检测的方法。该方法通过以下步骤实现：　　　　（１）样品处理及质谱标准化质控血清制备；　　　　（２）样品上样至磁珠基质上；　　　　（３）洗涤；　　　　（４）质谱的定量控制及质谱检测；　　　　其中所述步骤（１）将生物样品稀释在稀释缓冲溶液中。用Ｏ型血，男女相等，混合制备质谱的标准化质控血清；所述步骤（２）将质谱的标准化质控血清及样品点样在磁珠基质上。所述步骤（３）用结合缓冲液洗涤。在样品完全干燥前将第一份洗涤溶液加到该位点。洗涤溶液在位点上至少停留１０秒。彻底清除第一份洗涤溶液，用第二份洗涤液重复以上步骤。用０．５～２％三氟乙酸彻底洗涤磁珠，将生物标志洗脱至质谱专用的金属片上，自然干燥金属片，加０．５μＬ以５０％乙腈，０．５％二氟乙酸制备的吸能分子标准溶液。吸能分子可用Ｓｉｎａｐｉｎｉｃ　　ａｃｉｄ或ａｌｐｈａ－Ｃｙａｎｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ　　ａｃｉｄ等；所述步骤（４）用激光解吸／离子化飞行时间质谱仪，用氮激光仪（３３７ｎｍ）和８０ｃｍ或１２０ｃｍ飞行管分析阵列去分析变异的补体蛋白Ｃ３ａ生物标志。用计算机分析数据为８９３８±１５Ｄａ峰值。定量性质谱调控：每次测试前，用质谱的标准化质控血清，将标准化质控血清中用于定量的标准峰４０９１．１Ｄａ或６６３４．０Ｄａ强度调至５０％信号强度的最大值。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许洋，
申请(专利权)人：许洋，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]