MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合，包括MTHFR C677T、MTHFR A1298C、MTRR A66G基因多态性检测引物与探针组合。本发明专利技术还提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：核酸释放剂，2×PCR反应混合液(包含热启动Taq DNA聚合酶、UDG酶)，3组特异性引物，3组特异性探针和内标系统。本试剂盒仅需在常温下对2μl血液样本进行短暂处理便可得到用于多次检测的高质量DNA；检测特异性好，与金标准测序法符合率为100％；灵敏度高，可对0.2ng基因组DNA准确分型；检测流程耗时短，从样本处理到检测结果可在1小时内完成。

Primers, probes, kits and applications of MTHFR and MTRR gene polymorphism detection

The invention provides a MTHFR and MTRR gene polymorphism detection primer and probe combination, including MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTRR A66G gene polymorphism detection primer and probe combination. The invention also provides a detection kit for MTHFR and MTRR gene polymorphism, the kit includes the following components: nucleic acid releaser, 2 \u00d7 PCR reaction mixture (including hot start Taq DNA polymerase and UDG enzyme), 3 groups of specific primers, 3 groups of specific probes and internal standard system. This kit only needs to process 2 \u03bc l blood samples at room temperature for a short time to obtain high-quality DNA for multiple tests; the detection specificity is good, and the coincidence rate with gold standard sequencing method is 100%; the sensitivity is high, and it can accurately classify 0.2ng genomic DNA; the detection process is short, and it can be completed within 1 hour from sample processing to detection results.

【技术实现步骤摘要】
MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种MTHFR和MTRR基因多态性快速检测引物、探针、试剂盒及其应用。
技术介绍
叶酸是一种水溶性B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。叶酸代谢通路中的关键酶活性降低会导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，是新生儿出生缺陷、孕妇妊娠高血压、自发性流产、男性精子质量下降、H型高血压、动脉粥样硬化和冠心病的重要危险因素之一。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)是影响叶酸代谢的关键酶，其基因的多态性造成个体间叶酸利用能力差异，包括MTHFR基因的C677T、A1298C和MTRR基因的A66G多态性。MTHFR基因C677T位点的CC、CT、TT基因型在中国人群中的所占的比例分别为22％、50％、28％；A1298C位点的AA、AC、CC基因型在中国人群中所占的比例分别为66％、31％、4％；MTRR基因A66G位点的AA、AG、GG基因型在中国人群中所占的比例分比为58％、36％、6％。通过检测MTHFR基因和MTRR基因多态性，指导个体根据自身基因型合理准确地制定叶酸增补计划，预防因叶酸缺乏导致的相关疾病的发生。目前用于MTHFR和MTRR基因多态性检测的方法主要有DNA测序法、基因芯片法、高分辨率熔解曲线法(HRM)、荧光定量PCR法。其中，DNA测序法是突变检测金标准，但此方法存在操作复杂、检测周期长、容易污染、成本高等缺点；基因芯片法芯片制备难度高、操作繁琐、检测成本昂贵；HRM法对设备要求高，需配置专门分析软件，限制了该方法的普及；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法一般采用Genotyping方法进行基因分型，对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确分型。此外，以上检测方法使用的模板DNA均需要经过繁琐的提取和纯化步骤，不仅操作耗时、成本高，而且容易导致核酸损失并造成样本间交叉污染。因此，需要建立一种快速有效的检测少量样本MTHFR和MTRR基因多态性的方法。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针、试剂盒及应用。在阐述本
技术实现思路
之前，定义本文中所使用的术语如下：术语“MTHFR”是指：5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶。术语“MTRR”是指：甲硫氨酸合成酶还原酶。术语“PCR”是指：聚合酶链式反应。术语“FAM”是指：6-羧基荧光素。术语“HEX”是指：六氯-6-甲基荧光素。术语“ROX”是指：羧基-X-罗丹明。术语“NFQ”是指：非荧光淬灭基团。术语“MGB”是指：小沟结合物。术语“BHQ2”是指：荧光淬灭基团。术语“NP40”是指：乙基苯基聚乙二醇。术语“EDTA”是指：乙二胺四乙酸。术语“BSA”是指：牛血清白蛋白。术语“DMSO”是指：二甲基亚砜。术语“UDG酶”是指：尿嘧啶-DNA糖基化酶。为实现上述目的，本专利技术的第一方面提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合，所述组合包括：(1)MTHFRC677T基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的MTHFRC677T上游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:2所示的MTHFRC677T下游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:7所示的MTHFRC677T677C检测探针、核苷酸序列为SEQIDNO:8所示的MTHFRC677T677T检测探针；(2)MTHFRA1298C基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQIDNO:3所示的MTHFRA1298C上游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:4所示的MTHFRA1298C下游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:9所示的MTHFRA1298C1298A检测探针、核苷酸序列为SEQIDNO:10所示的MTHFRA1298C1298C检测探针；和(3)MTRRA66G基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQIDNO:5所示的MTRRA66G上游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:6所示的MTRRA66G下游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:11所示的MTRRA66G66A检测探针、核苷酸序列为SEQIDNO:12所示的MTRRA66G66G检测探针；其中，所述检测探针的5′端标记有FAM或HEX，3′端标记有NFQ-MGB。本专利技术的第二方面提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒包括：如第一方面所述的基因多态性检测引物和探针组合；内标系统；核酸释放剂；和2×PCR反应混合液。根据本专利技术第二方面的试剂盒，其中，所述内标系统包括内标引物和内标探针，所述内标引物包括核苷酸序列为SEQIDNO:13所示的GAPDH上游引物和SEQIDNO:14所示的GAPDH下游引物，所述内标探针包括核苷酸序列为SEQIDNO:15所示的检测探针，其中，所述内标探针5′端修饰有ROX荧光基团，3′端修饰有BHQ2。根据本专利技术第二方面的试剂盒，其中，所述核酸释放剂包括：终浓度为0.1～5％体积分数NP40、100～200mmol/LKCl、5～20mmol/LEDTA、10～20％体积分数BSA、10～30％体积分数DMSO，且所述核酸释放剂的pH值为7.0～8.5；优选地，所述核酸释放剂包括：终浓度为1％体积分数NP40、150mmol/LKCl、10mmol/LEDTA、15％体积分数BSA、20％体积分数DMSO，且所述核酸释放剂的pH值为8.2。根据本专利技术第二方面的试剂盒，其中，所述试剂盒中包括三个PCR反应管，其中，每个PCR体系中含有2×PCR反应混合液、如第一方面所述的引物与探针组合和内标系统。根据本专利技术第二方面的试剂盒，其中，所述每个PCR体系中PCR反应混合液的体积为10μl，所述各引物的体积为0.1μM～1μM，所述各探针的终浓度为50nM～250nM；优选地，各引物的终浓度为0.1μM，所述各探针的终浓度为100nM。本专利技术的第三方面提供了一种MTHFR和MTRR基因多态性检测方法，使用第二方面所述的试剂盒，所述方法包括以下步骤：(1)将待测样本加入到所述核酸释放剂中，涡旋充分混匀，室温放置1～30优选为5分钟，瞬时离心备用；(2)配置PCR反应体系，每个样本的MTHFR和MTRR基因多态性分3管检测；(3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行实时荧光定量检测。根据本专利技术第三方面的方法，其中，所述步骤(3)中，所述荧光定量检测，反应条件为：95℃预变性30秒；95℃10秒，62℃30秒，40个循环,并在62℃时收集FAM、HEX和ROX信号。根据本专利技术第三方面的方法，其中，所述PCR反应体系中，所述样本的加入量为4μl。本专利技术的第四方面提供了第一方面所述的MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合或第二方面所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗叶酸缺乏导致的相关疾病的药物中的应用。本专利技术的目的之一在于提供一种MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，克服现有技术中的不足，旨在解决现本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合，其特征在于，所述组合包括：(1)MTHFR C677T基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的MTHFR C677T上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的MTHFR C677T下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示的MTHFR C677T 677C检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示的MTHFR C677T 677T检测探针；(2)MTHFR A1298C基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示的MTHFR A1298C上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的MTHFR A1298C下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示的MTHFR A1298C 1298A检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示的MTHFR A1298C 1298C检测探针；和(3)MTRR A66G基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的MTRR A66G上游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的MTRR A66G下游引物、核苷酸序列为SEQ ID NO:11所示的MTRR A66G 66A检测探针、核苷酸序列为SEQ ID NO:12所示的MTRR A66G 66G检测探针；其中，所述检测探针的5′端标记有FAM或HEX，3′端标记有NFQ‑MGB。...

【技术特征摘要】
1.一种MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和探针组合，其特征在于，所述组合包括：(1)MTHFRC677T基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQIDNO:1所示的MTHFRC677T上游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:2所示的MTHFRC677T下游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:7所示的MTHFRC677T677C检测探针、核苷酸序列为SEQIDNO:8所示的MTHFRC677T677T检测探针；(2)MTHFRA1298C基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQIDNO:3所示的MTHFRA1298C上游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:4所示的MTHFRA1298C下游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:9所示的MTHFRA1298C1298A检测探针、核苷酸序列为SEQIDNO:10所示的MTHFRA1298C1298C检测探针；和(3)MTRRA66G基因多态性检测引物与探针组合：包括核苷酸序列为SEQIDNO:5所示的MTRRA66G上游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:6所示的MTRRA66G下游引物、核苷酸序列为SEQIDNO:11所示的MTRRA66G66A检测探针、核苷酸序列为SEQIDNO:12所示的MTRRA66G66G检测探针；其中，所述检测探针的5′端标记有FAM或HEX，3′端标记有NFQ-MGB。2.一种MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的基因多态性检测引物和探针组合；内标系统；核酸释放剂；和2×PCR反应混合液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述内标系统包括内标引物和内标探针，所述内标引物包括核苷酸序列为SEQIDNO:13所示的GAPDH上游引物和SEQIDNO:14所示的GAPDH下游引物，所述内标探针包括核苷酸序列为SEQIDNO:15所示的检测探针，其中，所述内标探针5′端修饰有ROX荧光基团，3′端修饰有BHQ2。4.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘永，吴建榕，孙淼，
申请(专利权)人：北京协和洛克生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京,11