新石莼聚糖裂解酶及其用于裂解多糖的用途制造技术

本发明专利技术涉及一种新的石莼聚糖裂解酶，编码所述酶的核酸序列，含有所述编码序列的载体，制备所述石莼聚糖裂解酶的方法，以及利用所述酶生产具有生物活性的石莼寡糖的方法。

Neolithic Ulva Polysaccharide Lysate and Its Application in Polysaccharide Lysate

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新石莼聚糖裂解酶及其用于裂解多糖的用途
本专利技术涉及一种新的石莼聚糖(石莼聚糖，ulvan)裂解酶，对该酶进行编码的核酸序列，含有所述编码序列的载体，制备该石莼聚糖裂解酶的方法，以及利用该酶生产具有生物活性的石莼寡糖(石莼聚糖寡聚物，石莼聚糖低聚糖，ulvanoligosaccharides)的方法。本专利技术主要应用于农业、动物和人类营养品工业，化妆品，制药业等。而且，也应用于标准分子、尺寸标记物(sizemakers)等生产或不同性质和来源的石莼寡糖的组合物结构的精细分析的实验室研究领域。在以下说明书中，方括号([])中的标号是指本文末尾提供的参考文献列表。
技术介绍
石莼科(ulvaceae)的绿色大型藻类遍布地球的任何地方，并且很常见于海岸上。这些藻类常常牵涉由沿海水域富营养化所促进的藻类繁殖，从而产生“绿潮”。然而，直到现在，它们仍构成了生物技术中未充分利用的巨大生物量，并且主要用作堆肥。存在于石莼壁中的主要复合阴离子多糖(石莼聚糖)是具有原始结构并且表示其功能性尚未被探索的生物聚合物源的糖醛酸多糖(uronicpolysaccharides)和硫酸化多糖。石莼聚糖及衍生的寡聚糖具有许多备受关注的生物学特性，特别是由于它们与动物的硫酸化糖胺聚糖(粘多糖，glycosaminoglycans)(例如肝素、硫酸皮肤素等)相似。石莼聚糖由不同的二糖重复单元组成，所述二糖重复单元由L-鼠李糖单元、D-葡糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-木糖和酯硫酸酯基团组成。两个主要的重复基序称为双己糖醛酸(aldobiuronicacid)或石莼聚糖醛酸(ulvanobiuronicacid)，或分别为A(A3S)和B(B3S)，其通式如下：基序A(A3S)是β-D-1,4-葡糖醛酸(1→4)α-L-1,4-鼠李糖3-硫酸酯。基序B(B3S)是α-L-1,4-艾杜糖醛酸(1→4)α-L-1,4-鼠李糖3-硫酸酯。应注意，L-艾杜糖醛酸是D-葡糖醛酸的C5差向异构体。糖醛酸有时在O-2替换为硫酸化的木糖残基。石莼聚糖具有独特的物理和化学特性，使其成为新农业食品、药品和化妆品应用中具有吸引力的候选物。石莼聚糖具有非常原始的结构，该机构由稀有糖或单糖(如鼠李糖)和艾杜糖醛酸组成。鼠李糖是许多被哺乳动物凝集素特异性识别的微生物的表面抗原的重要化合物。其还用于合成风味剂。艾杜糖醛酸用于合成糖胺聚糖，例如肝素。因此，由于硫酸化糖和D-葡糖醛酸和L-艾杜糖醛酸的结合，石莼聚糖可以被认为是动物和人的糖胺聚糖的仿生物(模拟物，biomimetics)。除单体外，石莼聚糖和寡聚石莼聚糖表现出备受关注的生物学特性。事实上，研究表明，例如，寡聚石莼聚糖具有抗肿瘤，抗病毒，特别是抗流感和抗凝血活性。Lahaye和Robic提出了石莼聚糖潜在应用的非穷举式列表(Biomacromolecules,8:1765-1774,2007)[1]。在本文中，引起极大兴趣的是更好地理解石莼聚糖的结构和发展使寡聚或单体形式的石莼聚糖片段化的方法。目前，在没有能够更好地了解石莼聚糖并且更有效地降解它们的手段的情况下，藻类、特别是绿藻基本上用作堆肥，并且很少对其进行工业开发。更令人遗憾的是，因为其来源丰富，有时对我们沿海地区造成污染的问题。这些藻类的消除目前受到堆肥方法的影响。酸性水解基本上是唯一释放石莼寡糖的方法，但这一方法是无规则的并且改变该聚合物的结构。某些海洋细菌分泌参与藻类多糖特异性降解的酶。利用特异性的酶使其可再现地释放寡聚糖同时保留其结构和生物活性。购自NonlabensulvanivoransPLR(以前称为PersicivirgaulvanivoransPLR)的石莼聚糖裂解酶已被专利进行了描述和保护(NyvallCollenetal.,J.Biol.Chem.,286(49):42063-42071,2011；国际申请WO2011157966)[2,3]。然而，这种酶在大肠杆菌中以可溶和活性的形式得到极其微弱的表达[2](参见下面图1中我们自己的结果)；这实际阻止对该酶的任何工业开发。因此，需要一种新的手段和/或方法以弥补现有技术的缺陷、缺点和障碍，特别是一种新的手段和/或方法使得有可能降解石莼聚糖以发展这种生物(特别是来自绿藻)的资源，从而以受控和可再现的方式释放具有确定结构的新石莼寡糖，并且同时保留所述寡聚糖的精细结构并因此保留在化妆品、农业食品和医疗中的应用。
技术实现思路
本专利技术人通过在大肠杆菌中识别(鉴定，identifying)、克隆和异源过表达并首次从海洋细菌嗜琼脂华美菌(Formosaagariphila)DSM15362的完整基因组中纯化了新的活性石莼聚糖裂解酶来满足这种需要(Mannetal.,Appl.Env.Microbiol.,79:6813-6822,2013；Nedashkovskayaetal.,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,56:161-167,2006)[4,5]。此外，利用这种酶完全降解石莼聚糖，可以分离和纯化具有独特的硫酸化化学结构的新的石莼寡糖(或寡聚石莼聚糖)。这些硫酸化的寡聚糖在生物医学科学、化妆品、营养学、植物诱导(elicitation)等方面具有潜在的应用价值。这种酶还可以提高含有石莼聚糖的大型绿色藻类中其他化合物(如蛋白质、色素、次级代谢产物)的提取率。因此，本专利技术人已经证明，嗜琼脂华美菌DSM15362的石莼聚糖裂解酶可以：(i)解聚石莼聚糖(大型绿色藻类的主要多糖)，释放具有生物活性的寡聚糖同时保留其天然结构；(ii)直接降解大型绿色藻类以产生含有具有生物活性的寡聚糖的级分；和(iii)增加来自大型绿色藻类的其他化合物(如蛋白质、色素等)的提取率。因此，本专利技术涉及包含或由氨基酸序列SEQIDNo:2组成的嗜琼脂华美菌DSM15362的石莼聚糖裂解酶，或涉及包含或由与序列SEQIDNo:2具有至少53％序列同一性的氨基酸序列组成的石莼聚糖裂解酶，或涉及包含或由氨基酸序列SEQIDNo:4或5组成的嗜琼脂华美菌DSM15362的石莼聚糖裂解酶，或涉及包含或由与序列SEQIDNo:4具有至少67％序列同一性的氨基酸序列组成的石莼聚糖裂解酶。序列SEQIDNo:4和5分别代表嗜琼脂华美菌DSM15362的石莼聚糖裂解酶的催化模块，并且所述模块以重组的形式产生(在大肠杆菌的细胞质中)。另外的N端序列是聚组氨酸标记以促进纯化。优选地，本专利技术涉及嗜琼脂华美菌DSM15362的石莼聚糖裂解酶的催化模块，其由序列SEQIDNo:4组成，或包含SEQIDNo:5序列或由序列SEQIDNo:5组成。根据本专利技术，这些石莼聚糖裂解酶或石莼聚糖裂解酶催化模块(无论它们的序列如何)还可以包含其N端、信号序列或寻址序列。该信号序列可以是本领域技术人员已知的信号序列之一，从而当蛋白质在宿主细胞中合成时，该蛋白质被导向宿主细胞或宿主细胞的特定区域。例如，它可以是在专门用于预测信号肽的位点中存在的信号序列，例如http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/[10]。例如，它可以是所附序列的列表的SEQIDNo:6序列，例如在序列SEQIDNo:4的N端。可以在该蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种石莼聚糖裂解酶，包含序列SEQ ID No:2、4或5，或者与序列SEQ ID No:2或4具有至少53％序列同一性的序列，并且在N端还包含序列SEQ ID No:6的信号序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.09.13 FR 16585051.一种石莼聚糖裂解酶，包含序列SEQIDNo:2、4或5，或者与序列SEQIDNo:2或4具有至少53％序列同一性的序列，并且在N端还包含序列SEQIDNo:6的信号序列。2.一种编码权利要求1中限定的石莼聚糖裂解酶的核酸。3.根据权利要求2所述的核酸，包含序列SEQIDNo:1或3。4.一种包含权利要求2或3中任一项所述的核酸的载体。5.一种包含...

【专利技术属性】
技术研发人员：古尔万·米歇尔，亚历克西娅·吉尤佐，贝蒂尔·马斯，萨比娜·热尼科，阿涅丝·格鲁瓦西耶，
申请(专利权)人：国立科学研究中心，索邦大学，
类型：发明
国别省市：法国,FR