本发明专利技术提供一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，载紫杉醇微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡；载siRNA微泡为PLGA包裹siRNA微泡；载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡混合物。载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡的混合物。其制备方法包括载紫杉醇微泡的制备及载siRNA微泡的制备。本发明专利技术将其应用于制备抑制宫颈癌的药物上。实验表明超声介导载紫杉醇及载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞分别有一定的抑制作用，两者联合应用，其协同抑制宫颈癌Caski细胞增殖的效果更好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术提供一种利用超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡联合靶向抑制宫颈癌的技术方案，属于生物医药领域。
技术介绍
据世界卫生组织国际癌症研究署(International Agency forResearch on Cancer，IARC)统计，宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，全球宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，占所有女性恶性肿瘤的13％。有调查统计，我国的宫颈癌发病率为12.96/10万，死亡率为4.32/10万，呈明显增长趋势。目前,宫颈癌的传统治疗方式主要有手术治疗、放疗、化疗等，但这些治疗方法均存在着相对的不足。近年来，有学者通过利用不同的超声物理学参数，不同种类的药物载体如微泡、微胶粒和脂质体等，以及不同的超声生物学效应(高热、声孔效应等)，来验证利用超声给药是一种新型的有前途的给药方式。超声介导超声微泡作为一种安全有效地给药途径，可以大力推广。近年，有国外学者采用可降解生物高分子聚合材料，制备的显影效果好、抗压性强的新型高分子材料超声微泡，可使药物释放时间及降解时间延长，并减少药物毒性及对组织的损伤，显示出这类新型微泡对肿瘤靶向释药能力及药物治疗作用的优势。
技术实现思路
本专利技术利用超声介导载紫杉醇微泡及载siRNA微泡，进行药物靶向释放，用于治疗宫颈癌的实验研究。通过自制高分子材料PLGA为外壳，包裹紫杉醇及针对HPV16E6、E7特异性的siRNA，制备载药、载siRNA微泡，在体外作用于宫颈癌细胞，初步评价超声介导载紫杉醇及载siRNA微泡联合应用对宫颈癌的协同抑制效果，为进一步临床应用研究提供实验依据。方法：(1)利用改良型双乳剂挥发法和低温真空干燥技术，自制出载紫杉醇和载siRNA的PLGA超声微泡。(2)实验将宫颈癌Caski细胞分为四组：空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组、联合载紫杉醇及载siRNA微泡组。按照最佳参数给予相同频率及时间强度的超声辐照，48小时后，进行WB检测凋亡蛋白、FCM检测细胞凋亡率及细胞周期的改变，评价超声介导载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡对宫颈癌细胞协同抑制作用的效果。具体如下：一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，载紫杉醇微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡；载siRNA微泡为PLGA包裹siRNA微泡；载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡混合物。所述的载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡的混合物。载紫杉醇和/或载siRNA微泡的制备方法，包括如下步骤：(1)载紫杉醇微泡，取紫杉醇溶于聚乙二醇400作为内水相(W1)，聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷作为油水相(O)，配置质量浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液；混合内水相W1和油水相O得到初乳(W/O)，配制质量浓度为3-8％聚乙烯水溶液作外水相(W2)，将外水相加入到初乳中，均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌3-8min乳化形成复乳(W/O/W)，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末，即为载紫杉醇微泡。(2)载siRNA微泡，将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒以及灭菌后的物品放置于质量浓度为0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶；将DEPC水重悬siRNA，得到已溶解的siRNA溶液；称量聚乳酸羟基乙酸(PLGA)溶于二氯甲烷中，配置浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液；将已溶解的siRNA溶液加入到混合好的二氯甲烷聚乳酸羟基乙酸PLGA溶液中，形成油水相，均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌30-40s，形成乳白色油包水乳液，配制质量浓度为3-8％的聚乙烯PVA水溶液，为外水相；将外水相加入到上述siRNA与PLGA乳白色油包水乳液，形成复乳，均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌3-8min，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末，得到载siRNA微泡；(3)载紫杉醇和siRNA微泡，经步骤(1)中的载紫杉醇微泡与步骤(2)中的载siRNA微泡混合得到。本专利技术将所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡在制备抑制宫颈癌的药物上的应用。该应用是超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞的抑制。具体方法为：配制浓度为2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液，浓度为10ug/ml的载siRNA微泡溶液，及2ug/ml的载紫杉醇微泡溶液与浓度为10ug/ml的载siRNA微泡溶液的混合液，将实验分为四组：空白对照组，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，载紫杉醇微泡及载siRNA微泡组，四组不同处理溶液加入宫颈癌Caski细胞中，用频率为1.5W/cm2的超声基因转染仪辐照35s，将处理后的四组24孔板放置CO2细胞培养箱中，48h小时后，完成超声介导载紫杉醇和/或载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞。结果：(1)通过改良型双乳剂挥发法和真空冷冻干燥技术，制备出载紫杉醇和载siRNA的PLGA超声微泡，形态规则呈球形，粒径分布均匀，包封率达到89.58％，载药率达到11.86％，达到进一步实验的要求。(2)与空白对照组相比，载紫杉醇微泡组宫颈癌Caski细胞增殖受到一定程度抑制，载siRNA微泡组宫颈癌Caski细胞增殖有一定抑制，联合载紫杉醇及载siRNA微泡组宫颈癌Caski细胞增殖的抑制作用更加明显；载紫杉醇组及载siRNA组的Bax、Caspase3促凋亡蛋白的表达均上调，联合组的上调幅度更大(p<0.05)，
载紫杉醇组及载siRNA组的Bcl2抑凋亡蛋白下调，联合组的下调幅度更大(p<0.05)；流式细胞仪检测空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组、联合组的细胞凋亡率分别为：(8.39±0.24)％、(21.56±2.20)％、(11.00±0.14)％、(27.9±0.76)％，与空白对照组相比，载紫杉醇组与载siRNA组的凋亡率均增高，联合组的凋亡率最高(p<0.05)；流式细胞仪检测细胞周期的变化显示，载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组，联合组阻滞在G2/M期细胞数目增加，其中联合组的阻滞在G2/M期细胞数目明显高于其余三组(p<0.05)。自制PLGA超声微泡，其形态、粒径分布、包封率、载药率达到实验要求。体外实验表明，超声介导载紫杉醇及载siRNA微泡对宫颈癌Caski细胞分别有一定的抑制作用，两者联合应用，其协同抑制宫颈癌Caski细胞增殖的效果更好。本实验研究结果为临床上探索宫颈癌治疗提供了一种新的思路。附图说明图1为PLGA载紫杉醇微泡的扫描电镜图。图2为PLGA载siRNA微泡的扫描电镜图。图3为流式细胞仪检测空白对照组、载紫杉醇微泡组、载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组的细胞凋亡率(与空白对照组相比，*p<0.05,**p<0.01)。其中，N为空白对照，P为载紫杉醇微泡组，S为载siRNA微泡组，PS为载siRNA微泡组及载紫杉醇微泡联合载siRNA微泡组。图4为流式细胞仪检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，其特征在于，载紫杉醇微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡；载siRNA微泡为PLGA包裹siRNA微泡；载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡混合物。
【技术特征摘要】
1.一种载紫杉醇和/或载siRNA微泡，其特征在于，载紫杉醇微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡；载siRNA微泡为PLGA包裹siRNA微泡；载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡混合物。2.权利要求1所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡，其特征在于，载紫杉醇和siRNA微泡为PLGA包裹紫杉醇微泡与PLGA包裹siRNA微泡的混合物。3.权利要求1所述的载紫杉醇和/或载siRNA微泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)载紫杉醇微泡，取紫杉醇溶于聚乙二醇400作为内水相(W1)，聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于二氯甲烷作为油水相(O)，配置质量浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙酸共聚物二氯甲烷溶液；混合内水相W1和油水相O得到初乳(W/O)，配制质量浓度为3-8％聚乙烯水溶液作外水相(W2)，将外水相加入到初乳中，均质机以10000rpm的转速持续震荡搅拌3-8min乳化形成复乳(W/O/W)，磁力搅拌机搅拌，离心，洗涤，真空冷冻干燥，灭菌，收集灭菌微泡粉末，即为载紫杉醇微泡。(2)载siRNA微泡，将实验所需的烧杯、离心管、玻璃棒以及灭菌后的物品放置于质量浓度为0.1％焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液中浸泡24h，以去除RNA酶；将DEPC水重悬siRNA，得到已溶解的siRNA溶液；称量聚乳酸羟基乙酸(PLGA)溶于二氯甲烷中，配置浓度为0.2-0.3g/ml的聚乳酸羟基乙酸(PLGA)二氯甲烷溶液；将已溶解的siRNA溶液加入到混合好的二...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵云，苏子涵，刘朝奇，于娇娇，胡兵，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。