一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，该谷氨酸脱羧酶突变体为下列之一：将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第383位的苏氨酸突变为赖氨酸；将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第163位的丙氨酸突变为丝氨酸。本发明专利技术通过序列一致性方法对GAD1407基因编码的氨基酸序列中出现频率最高(保留阈值在60％以上)的8个位点进行定点突变，筛选获得酶活力性和热稳定性显著高于野生型酶的谷氨酸脱羧酶突变体(突变体T383K和A163S)的t1/2分别是野生型的1.74和1.45倍，T50

A Glutamate Decarboxylase Mutant Prepared by Sequence Consistency and Its Application

【技术实现步骤摘要】
一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用
本专利技术涉及酶工程
，尤其涉及一种通过序列一致性制备的谷氨酸脱羧酶突变体及其应用。
技术介绍
GABA(γ-Aminobutyricacid或γ-Aminobutanoicacid，简称GABA)是一种有生物活性的化合物，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质，具有预防癌症、减缓心血管疾病、抗惊厥、降血压、镇静安神、醒酒等作用。此外，GABA可用于合成N-吡咯烷酮和尼龙4，在食品、医药和化工等领域应用广泛。谷氨酸脱羧酶(glutamatedecarboxylase，GAD；EC4.1.1.15)是利用生物法制备GABA的关键酶。在辅酶磷酸吡哆醛(Pyridoxal5'-phosphate,PLP)存在下，GAD可专一性地催化L-谷氨酸(L-glutamicacid，L-Glu)脱去α-羧基生成GABA。由于天然的GAD催化效率低和稳定性差等缺点，在工业上的应用有限。因此，提高GAD的催化性能对其在工业上的应用有重要的意义。提高酶催化性能的方法有：利用半理性设计的方法在蛋白质底物口袋区域进行饱和突变；定点突变；引入二硫键；脯氨酸效应；利用FireProt对现有蛋白质进行快速和集中的重新设计等。一般来说，通过以上方法获得催化性能提高的突变株需要筛选大量的随机突变体，工作繁琐。幸运的是，根据序列或结构信息引导的序列一致性对同源基因中特定氨基酸进行突变可以提高定向进化的效率、减少工作量，该方法已成为改善酶催化性能的一种流行方法。研究表明，同源蛋白质中某位置发生频率较高的氨基酸更有助于提高蛋白质的稳定性。Lehmann等(LehmannM,LochC,MiddendorfA,etal.Theconsensusconceptforthermostabilityengineeringofproteins:furtherproofofconcept.ProteinEngineeringDesignandSelection,2002,15(5):403-11.)基于13个同源植酸酶序列，通过序列一致方法合成植酸酶基因，编码的蛋白质在热变性过程中比亲本蛋白更稳定。Xie等(XieDF,YangJX,LvCJ,etal.Constructionofstabilized(R)-selectiveaminetransaminasefromAspergillusterreusbyconsensusmutagenesis.JournalofBiotechnology,2019,293:8-16.)基于91个同源转氨酶序列，通过定点突变筛选到6个热稳定性提高的突变酶(I77L,Q97E,H210N,N245D,G292D,I295V)。
技术实现思路
本专利技术提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，该谷氨酸脱羧酶突变体通过序列一致性方法筛选获得，与野生型酶相比，其热稳定性显著提高。具体技术方案如下：本专利技术提供了一种谷氨酸脱羧酶突变体，其为下列之一：(1)将SEQIDNO.1所示氨基酸序列第383位的苏氨酸突变为赖氨酸；(2)将SEQIDNO.1所示氨基酸序列第163位的丙氨酸突变为丝氨酸。本专利技术中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列是来源于短乳杆菌Lb.brevisCGMCCNo.1306的GAD1407基因的编码蛋白，即野生型酶。本专利技术通过ConsensusFinder(http://cbs-kazlab.oit.umn.edu/)预测了GAD1407基因及其同源蛋白中稳定的取代氨基酸残基，并对取代氨基酸残基所对应的位点进行定点突变，获得突变体，然后验证这些突变体的热稳定性，得到了热稳定性显著提高的谷氨酸脱羧酶突变体。与野生型酶相比，上述谷氨酸脱羧酶突变体(即突变体T383K和突变体A163S)的t1/2分别是野生型的1.74和1.45倍，T5015分别比WT提高了2.9℃和1.76℃。上述谷氨酸脱羧酶突变体分别是由SEQIDNO.1所示氨基酸序列第383位的苏氨酸(密码子为ACT)突变为赖氨酸(密码子为AAA)，或者，由第163位的丙氨酸(密码子为GCC)突变为丝氨酸(密码子为AGC)。本专利技术还提供了所述谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因。进一步地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。本专利技术还提供了一种包含所述编码基因的表达单元。本专利技术还提供了一种包含所述表达单元的重组质粒。本专利技术还提供了一种包含所述重组质粒的基因工程菌。可以将目的基因片段整合到基因工程菌的基因组上，以获得稳定表达的谷氨酸脱羧酶突变体的基因工程菌，也可以通过质粒的形式存在。可以选择常用的用于蛋白表达的基因工程菌，优选为E.coliBL21(DE3)。本专利技术提供的谷氨酸脱羧酶突变体能够催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸。进一步地，本专利技术提供了一种催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：(1)制备表达谷氨酸脱羧酶突变体的基因工程菌，所述谷氨酸脱羧酶突变体如权利要求1所述；(2)培养所述基因工程菌，制备酶液；(3)将所述酶液加入至含有底物L-谷氨酸和磷酸吡哆醛的缓冲体系中进行反应，得到γ-氨基丁酸。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)本专利技术通过序列一致性方法对GAD1407基因编码的氨基酸序列中出现频率最高(保留阈值在60％以上)的8个位点进行定点突变，筛选获得热稳定性显著高于野生型酶的谷氨酸脱羧酶突变体；突变体T383K和突变体A163S的t1/2分别是野生型的1.74和1.45倍，T5015分别比WT提高了2.9℃和1.76℃。(2)本专利技术还运用分子动力学模拟技术和差示扫描荧光法鉴定突变位点对蛋白质热稳定性的影响，并证实突变酶T383K、A163S比野生型具有更高的耐热性。(3)本专利技术通过序列一致性方法提高了GAD的催化性能，不仅为GAD的工业应用提供了可靠方法，同时为提高其它酶的催化性能提供了指导。附图说明图1为实施例1中经序列一致分析后的8个突变体在GAD三级结构中的位置图(以球表示)及其序列一致性分析结果图；其中，取代残基用球表示，取代残基对表示为weblogo标志(横坐标表示氨基酸位点，符号高度反映相应氨基酸在该位置的相对频率)。图2为实施例1中野生型酶(WT)和突变体(H181R/T383K/A163S)的半衰期t1/2。图3为实施例1中野生型酶(WT)和突变体(H181R/T383K/A163S)的半失活温度T5015。图4为实施例2中野生型酶(WT)与突变体的分子动力学模拟分析；其中，A为313K下野生型酶WT与突变体H181R的RMSD值；B为313K下野生型酶WT与突变体T383K的RMSD值；C为313K野生型酶WT与突变体A163S的RMSD值；D为313K下野生型酶WT与突变体H181R的RMSF值；E为313K下野生型酶WT与突变体T383K的RMSF值；F为313K下野生型酶WT与突变体A163S的RMSF值。图5为实施例3中利用差示扫描荧光法测定的野生型(WT)和突变体(H181R/T383K/A163S)的去折叠情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步描述，以下列举的仅是本专利技术的具体实施例，但本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，为下列之一：(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第383位的苏氨酸突变为赖氨酸；(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第163位的丙氨酸突变为丝氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸脱羧酶突变体，其特征在于，为下列之一：(1)将SEQIDNO.1所示氨基酸序列第383位的苏氨酸突变为赖氨酸；(2)将SEQIDNO.1所示氨基酸序列第163位的丙氨酸突变为丝氨酸。2.如权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶突变体的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。4.一种包含权利要求2或3所述编码基因的表达单元。5.一种包含权利要求4所述表达单...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊，花雨娇，梅乐和，吕常江，王宏鹏，胡升，赵伟睿，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江,33