一种葡萄球菌裂解酶及其保存方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种能杀灭葡萄球菌，特别是能杀灭金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌等葡萄球菌属的裂解酶及其保存方法和应用。该葡萄球菌裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该葡萄球菌裂解酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该酶发挥作用的pH范围宽，在pH 6‑10都保持有裂解葡萄球菌的活力，采用编码基因构建的重组蛋白酶能在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶表达。该酶能用作治疗体内、体外葡萄球菌感染的抗生素，也能快速裂解葡萄球菌的细胞壁并释放胞内的物质，从而用来核酸提取、制备葡萄球菌检测和鉴定的药剂。试验证实，将该葡萄球菌裂解酶冻干后，其蛋白杀菌活性没有降低，因此，可以制成冻干粉保存。

A Staphylococcal Lysate and Its Preservation Method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄球菌裂解酶及其保存方法和应用
本专利技术涉及生物制剂领域，具体涉及一种能杀灭葡萄球菌，特别是能杀灭金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌等葡萄球菌属的裂解酶及其保存方法和在葡萄球菌杀灭、检测等方面的应用。
技术介绍
葡萄球菌是一种能够形成葡萄状细菌群落形态的革兰氏阳性细菌，能引起人和动物的多种疾病。金黄色葡萄球菌一直是医源性感染排名仅次于大肠杆菌的致病菌，能够引起脑膜炎、肺炎、脓毒症等症状，可通过食物、人群等传播，具有耐酸耐碱、高温、低温等特点，能在多种复杂环境中生存。多耐药性金黄色葡萄球菌的流行，使得开发新的抗菌剂迫在眉睫。噬菌体裂解酶是噬菌体在感染宿主菌后期产生的一种水解细菌细胞壁肽聚糖的水解酶，裂解酶大小通常为25kD～40kD，在结构上由两个独立的功能域构成，分别为N-端的催化功能域和一个决定细胞结合位点的C-端细胞壁结合功能域(CBD)，二者之间由一个小片段链接。因为其靶作用位点为细菌保守的成分，所以细菌很难对其产生抗性，目前也没有报道细菌对噬菌体裂解酶产生耐药。噬菌体裂解酶作为一种蛋白制剂，在体内用药必定有一定的免疫原性，而且具有半衰期短的缺点，大多数蛋白长期保存后，活性会降低很多。因此研发同时具有杀菌活性好、保存活性好的葡萄球菌噬菌体裂解酶可能会使葡萄球菌裂解酶的应用将受到更少的限制。
技术实现思路
针对现有技术中的技术空白，本专利技术的目的是提供一种葡萄球菌裂解酶及其保存方法和应用。这种裂解酶能在体外、体内杀灭葡萄球菌，特别是金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌等葡萄球菌属。为了叙述方便，将该葡萄球菌命名为ClyC。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供的一种葡萄球菌裂解酶ClyC，该葡萄球菌裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。编码权利要求1所述葡萄球菌裂解酶ClyC的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还公开了一种葡萄球菌裂解酶ClyC的可溶性表达与纯化方法，将SEQIDNO.2所示基因克隆表达后连接到pET28a载体上，然后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，所表达的蛋白质经镍柱纯化，再用Tris-HCl或PBS透析处理。本专利技术还公开了葡萄球菌裂解酶ClyC的保存方法，将所述裂解酶ClyC冻干成蛋白冻干粉保存。本专利技术试验证实，将葡萄球菌裂解酶ClyC冻干后，其蛋白杀菌活性没有降低。进一步地，所述蛋白冻干粉中添加钙离子，所述钙离子的添加量确保裂解酶工作时钙离子的浓度为10-1000μM。本专利技术试验了ClyC对钙离子的敏感程度，初步证实了钙离子可以显著提高ClyC的杀菌活性，并减少ClyC的使用剂量。本专利技术还进一步公开了裂解酶ClyC在制备体内、体外杀灭葡萄球菌的药剂中的用途。证实了该葡萄球菌裂解酶ClyC的高活性和对葡萄球菌的广谱性。进一步地，所述葡萄球菌选自金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌。本专利技术还初步试验了裂解酶ClyC对实验动物模型小鼠感染金黄色葡萄菌后的保护效果，以及对细胞毒性的测试，初步证实了其用于抗葡萄球菌感染药物开发的潜能。本专利技术还进一步公开了裂解酶ClyC在制备抗葡萄球菌感染药物中作为活性成分的用途。本专利技术还进一步公开了裂解酶ClyC在制备核酸提取试剂中的用途。用裂解酶ClyC与细菌作用后，释放菌内的三磷酸腺苷(ATP)或DNA等胞内物质。本专利技术还进一步公开了裂解酶ClyC在制备葡萄球菌检测和鉴定的试剂中的用途。用裂解酶ClyC试剂与待测细菌作用后，以释放菌内的三磷酸腺苷ATP作为荧光素酶激活荧光素产生较高荧光信号的能量来源来鉴定待测细菌。与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果如下：本专利技术提供的葡萄球菌裂解酶ClyC能在体内、体外杀灭各种葡萄球菌，包括金黄色葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、马胃葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌等菌属；裂解酶ClyC细胞毒性低，具有应用于抗葡萄球菌感染药物开发的潜能。裂解酶ClyC在大肠杆菌中表达量高，适合于发酵生产；裂解酶ClyC对EDTA很敏感，在pH6-10内都具有很高的活性。本专利技术的葡萄球菌裂解酶ClyC还可以快速裂解葡萄球菌的细胞壁并释放胞内的物质，从而用来核酸提取、制备葡萄球菌检测和鉴定的药剂。本专利技术提供的葡萄球菌裂解酶ClyC冻干后，其蛋白杀菌活性没有降低，因此可以作为冻干粉保存。并且试验证实，ClyC对钙离子的敏感程度，钙离子可以显著提高ClyC的杀菌活性，并减少ClyC的使用剂量。附图说明图1为ClyC基因PCR扩增结果。图中M为蛋白Marker，箭头所指处为750bp。R为扩增ClyC的条带。图2为ClyC的杀菌谱。纵坐标表示25μg/mlClyC与各葡萄球菌株以及其他菌株孵育10min后浊度降低的变化值。图3为ClyC在不同pH下对细菌的杀菌活性测试结果，其中纵坐标表示25μg/mlClyC在不同pH中相对活性。图4为不同浓度ClyC在PBS(图4B)和5％BSA(图4A)的缓冲液中杀菌能力的CFU计数。图5为ClyC体内杀灭金黄色葡萄球菌的结果。每组6只小鼠，分别注射致死剂量的金黄色葡萄球菌后，实验组于1小时后腹腔注射0.1mgClyC。对照组于1小时后腹腔注射等体积的PBS溶液。每天观测各组小鼠的存活率。图6为ClyC对于细胞毒性的测试结果。分别用浓度为15.625、31、62、125、250和500μg/mL的ClyC作用于CHO-K1细胞，在低于125μg/mL没有观察到明显的细胞毒性。图7为ClyC对钙离子敏感度结果。其中图7A为50μg/mlClyC、100μM钙离子、ClyC-Ca2+分别与细菌孵育不同时间后的CFU计数，纵坐标为log值。图7B为1mMCa2+与不同浓度ClyC的杀菌曲线。图7C为25μg/mlClyC对不同浓度钙离子敏感程度的结果。图8为冻干粉蛋白的活性，PlySs2(图8A)、ClyH(图8B)和ClyR(图8D)作为对照，图8C为ClyC蛋白冻干前加1mMCa2+、ClyC蛋白冻干后加1mMCa2+、以及ClyC蛋白不加Ca2+三种情况下对细菌的杀菌曲线图。图9为ClyC用于基于ATP释放的葡萄球菌快速检测结果。图中横坐标表示ClyC蛋白和菌液的混合物加入荧光反应底物后的检测时间，纵坐标表示荧光值。虚线连接符号×代表空白对照，和▕代表阴性对照，上升的曲线代表金黄色葡萄球菌菌株。具体实施方式下面申请人结合具体实施例对本专利技术技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为本专利技术请求保护范围的限定。以下说明中提到的其它裂解酶ClyR、ClyH、PlySs2等均为申请人实验室前期设计构建或参考文献序列表达纯化，仅为说明ClyC与其它裂解酶的性质差异。实施例1：葡萄球菌裂解酶ClyC的构建通过查阅文献以及实验验证，我们发现了一个与金黄色葡萄球菌肽聚糖亲和能力很高的噬菌体裂解酶结合域蛋白，将它和另外一个具有部分催化活性的噬菌体裂解酶催化域蛋白融合表达，得到一个新的葡萄球菌噬菌体裂解酶ClyC。本实验中的引物由上海生工公司完成。(1)在上海生工生物工程有限公司全序列合成能表达裂解酶ClyC的DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡萄球菌裂解酶，其特征在于，该葡萄球菌裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄球菌裂解酶，其特征在于，该葡萄球菌裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述葡萄球菌裂解酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述的葡萄球菌裂解酶的可溶性表达与纯化方法，其特征在于，将权利要求2所述基因克隆表达后连接到pET28a载体上，然后将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，所表达的蛋白质经镍柱纯化，再用Tris-HCl或PBS透析处理。4.权利要求1所述的葡萄球菌裂解酶的保存方法，其特征在于，将所述裂解酶冻干成蛋白冻干粉保存。5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：危宏平，李小红，杨航，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42