油酸水合酶及其在10-羟基硬脂酸与10-羰基硬脂酸合成中的应用制造技术

本发明专利技术涉及来源于嗜氨副球菌的油酸水合酶及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，其重组酶及制备方法，以及该重组酶作为催化剂在制备10‑羟基硬脂酸和10‑羰基硬脂酸的应用。与现有技术相比，应用本发明专利技术的油酸水合酶催化制备10‑羟基硬脂酸和10‑羰基硬脂酸，具有反应条件温和，产物浓度高，操作简便，反应时间短，易于放大等显著优势，具有很好的应用前景。

Oleic acid hydratase and its application in the synthesis of 10-hydroxy stearic acid and 10-carbonyl stearic acid

【技术实现步骤摘要】
油酸水合酶及其在10-羟基硬脂酸与10-羰基硬脂酸合成中的应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种嗜氨副球菌(Paracoccusaminophilus)来源的重组油酸水合酶，表达所述油酸水合酶的基因及其重组表达载体和重组表达转化体，该重组油酸水合酶的制备方法，以及利用该油酸水合酶作为催化剂催化制备10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸的应用。
技术介绍
传统化工产业以石油、天然气、煤炭等石化资源作为原料和能源，石化资源的大量消耗，造成了资源短缺以及全球气候变暖等严重问题，为缓解现有的这些问题，利用资源丰富、可再生的生物质资源，通过生物技术生产生物基燃料、材料和化学品的理念受到了广泛关注。油酸作为一种不饱和脂肪酸，是油脂类生物质的重要组成成分，资源非常丰富。以油酸作为出发原料，可以通过酶法转化制备10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸，这两种长链脂肪酸衍生物可以作为润滑剂、表面活性剂以及聚酯合成的原料；10-羰基硬脂酸还可以进一步通过酶法裂解制备癸二酸、羟基癸酸、癸醇、辛醇等中链脂肪族功能化学品。目前脂肪酸(包括油酸)的酶法催化转化研究主要集中在转化途径的建立和高活力酶的挖掘。2012年，Joo等从嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)中挖掘获得一个脂肪酸水合酶，使用重组表达该酶的大肠杆菌整细胞催化油酸水合转化为10-羟基硬脂酸，底物浓度为50g/L，整细胞催化剂用量为10g/L，反应4h，转化率为92％，时空产率为295g/L/d(J.Biotechnol.,2012,158(1-2):17-23)。2013年，Park课题组开发了一条多酶整细胞催化油酸转化、裂解的途径，其中脂肪酸水合酶催化的油酸水合反应是这条途径的第一步，也是比较关键的限速步骤。这条途径给脂肪酸的催化转化提供了新的方向，然而这条途径的底物上载量仅为1mM，转化率为60％(Angew.Chem.Int.Ed.,2013,52(9):2534-2537)，存在着油酸水合酶催化活性低、底物上载量低，反应时间长以及转化率低等问题。2015年，Lee等人在谷氨酸棒状杆菌中共表达了油酸水合酶和10-羟基硬脂酸脱氢酶，利用整细胞催化油酸一步转化生成10-羰基硬脂酸。该反应的底物上载量为2.5g/L(8.8mM)，整细胞催化剂的上载量为5g/L，反应6h后，转化率仅有78％，时空产率仅为16.5g/L/d(Biotechnol.Lett.,2015,37(5):1101-1106)。对于油酸水合酶催化生产10-羟基硬脂酸以及油酸水合酶和10-羟基硬脂酸脱氢酶的级联催化生产10-羰基硬脂酸的反应，前人的研究都存在底物上载量低，转化率低的现象，主要原因是现有的油酸水合酶的活力偏低，因此需要筛选高活力的油酸水合酶，在此基础上优化10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸合成的催化反应体系，以达到更优的反应效果。
技术实现思路
针对目前已报道的油酸水合酶活力低下，催化反应时空产率低的缺陷，本专利技术提供了一种具有高活性的油酸水合酶，表达所述油酸水合酶的基因及其重组表达载体和重组表达转化体，所述油酸水合酶的制备方法及其在合成10-羟基硬脂酸和10-羰基硬脂酸中的应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术的技术方案之一：提供了一种高活性的油酸水合酶。本专利技术以已报道的分别来源于Stenotrophomonasmaltophilia、Macrococcuscaseolyticus和Lysinibacillusfusiformis的油酸水合酶的氨基酸序列作为探针，在美国国立生物技术信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation)进行序列比对，挑选一致性为30％～70％的一批序列作为备选对象，设计相应的PCR扩增引物，对已有的微生物基因组DNA进行目的片段扩增。将扩增的目的片段克隆到大肠杆菌中进行候选酶的表达，对表达的候选油酸水合酶进行油酸水合反应的功能验证。在成功克隆表达的序列中，发现来源于嗜氨副球菌(Paracoccusaminophilus)JCM7686的一个油酸水合酶具有最高的活性，将该酶命名为PaOH。所述油酸水合酶PaOH的核酸序列如SEQIDNo.1所示，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。所述菌株嗜氨副球菌(Paracoccusaminophilus)JCM7686购自日本微生物菌种保藏中心。在获得油酸水合酶PaOH的基础上，采用易错PCR的策略对油酸水合酶PaOH进行定向进化，结合酶标仪高通量筛选方法，获得活性显著改善的油酸水合酶突变体。本专利技术提供一种活性显著改善的油酸水合酶，所述油酸水合酶是由下述氨基酸序列组成的蛋白质，(1)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(2)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；(3)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸；(4)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第254位组氨酸替换为酪氨酸；(5)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸；(6)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(7)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；(8)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(9)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(10)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第22位天冬酰胺替换为丝氨酸；(11)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第60位异亮氨酸替换为天冬酰胺；(12)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第300位天冬酰胺替换为天冬氨酸，第632位苏氨酸替换为异亮氨酸；(13)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第129位谷氨酸替换为甘氨酸，第368位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第626位苯丙氨酸替换为苏氨酸；(14)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第40位天冬酰胺替换为酪氨酸，第316位丙氨酸替换为苏氨酸，第356位丙氨酸替换为苏氨酸。本专利技术所述油酸水合酶的获得方法为本领域常规方法，较佳地为从重组表达上述油酸水合酶的转化体中分离获得；或者人工合成获得。本专利技术所述油酸水合酶的活力测定采用常规方法进行。例如，反应在2mlEppendorf管中进行，将适当稀释的酶液加入到含有底物油酸的柠檬酸-磷酸缓冲液(100mM,pH6.5)中，振荡反应4h后，加入20％(w/v)的硫酸溶液终止反应，乙酸乙酯萃取、干燥过夜。干燥后的萃取上清液加入适量的吡啶和N,O-双三甲硅基三氟乙酰胺(BSTFA)，对脂肪酸底物和产物进行衍生化处理，再进行气相色谱检测，分析底物和产物的含量，计算反应的转化率。油酸水合酶的活力单位(U)定义为：上述反应条件下，每分钟催化1.0μmol油酸转化生成10-羟基硬脂酸所需的酶量。本专利技术的技术方案之二：提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种油酸水合酶，其特征在于，其是由下述氨基酸序列组成的蛋白质：(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸；(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第254位组氨酸替换为酪氨酸；(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸；(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第22位天冬酰胺替换为丝氨酸；(11)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第60位异亮氨酸替换为天冬酰胺；(12)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第300位天冬酰胺替换为天冬氨酸，第632位苏氨酸替换为异亮氨酸；(13)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第129位谷氨酸替换为甘氨酸，第368位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第626位苯丙氨酸替换为苏氨酸；(14)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列中的第40位天冬酰胺替换为酪氨酸，第316位丙氨酸替换为苏氨酸，第356位丙氨酸替换为苏氨酸。...

【技术特征摘要】
1.一种油酸水合酶，其特征在于，其是由下述氨基酸序列组成的蛋白质：(1)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(2)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；(3)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸；(4)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第254位组氨酸替换为酪氨酸；(5)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸；(6)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(7)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；(8)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第332位组氨酸替换为酪氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(9)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第221位谷氨酰胺替换为半胱氨酸，第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(10)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第22位天冬酰胺替换为丝氨酸；(11)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第60位异亮氨酸替换为天冬酰胺；(12)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第300位天冬酰胺替换为天冬氨酸，第632位苏氨酸替换为异亮氨酸；(13)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第129位谷氨酸替换为甘氨酸，第368位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第626位苯丙氨酸替换为苏氨酸；(14)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第40位天冬酰胺替换为酪氨酸，第316位丙氨酸替换为苏氨酸，第356位丙氨酸替换为苏氨酸。2.一种核酸，其特征在于，编码如权利要求1所述的油酸水合酶。3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体。5.如权利要求1所述油酸水合酶的制备方法，其特征在于，培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离重组表达的油酸水合酶。6.一种油酸水合酶的应用，其特征在于，所述油酸水合酶作为催化剂，催化底物油酸的水合反应制备10-羟基硬脂酸；所述油酸水合酶是由下述氨基酸序列组成的蛋白质，(1)如SEQIDNo.2所示氨基酸序列；(2)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第444位酪氨酸替换为苯丙氨酸；(3)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为谷氨酸；(4)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第451位天冬氨酸替换为苏氨酸；(5)将如SEQIDNo.2所示氨基酸序列中的第2...

【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，吴艳霞，潘江，郁惠蕾，孙启帆，钱小龙，
申请(专利权)人：华东理工大学，苏州百福安酶技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31