一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种酶法降解4‑氨基水杨酸的方法，包括提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因；制作含有Sdc基因的重组质粒；构建Sdc大肠杆菌表达菌株，诱导表达；超声破碎Sdc大肠杆菌，纯化水杨酸脱羧酶；设置反应箱及反应体系。本发明专利技术取代传统降解4‑氨基水杨酸需经高温的技术条件，从而使分解反应更易进行且能耗更低、降解效率更高；利用基因工程可制备大量水杨酸脱羧酶，使水杨酸脱羧酶的应用工业化，提高单位时间内的代谢产量；配制代谢效率最高的反应体系，反应体系中加入的氯化亚铁，在反应箱上设置抽气泵，可提高酶反应活性，并且防止逆反应的发生，提升分解效率；质谱法测量酶活相比现有技术的比色法更加准确。

A method of enzymatic degradation of 4-aminosalicylic acid

【技术实现步骤摘要】
一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法
本专利技术涉及一种方法，尤其涉及一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法。
技术介绍
水杨酸及其衍生物在医药、化工等领域应用广泛，但由于其有毒且自然降解时间长，会影响自然生态平衡和人类健康，因此，研究其降解方法对于实现绿色生产具有重要意义和必要性[1-3]。而且，水杨酸及其衍生物的脱羧产物——苯酚及其衍生物，也是重要的有机化工原料，在化学工业、医药工业有着广泛的应用，既可作为化学合成的中间体，也是重要的化学药品原料。4-氨基水杨酸在40℃以上的水溶液中不稳定，分解并放出二氧化碳而成为间氨基酚。现有技术中分解4-氨基水杨酸主要依靠加热手段，工厂化应用会耗费大量热能，并且随着逆反应的进行而使分解效率低下。
技术实现思路
为了解决上述技术所存在的不足之处，本专利技术提供了一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法。为了解决以上技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法，包括以下步骤：Ⅰ、提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因；在LB液体培养基中活化丝孢酵母并从丝孢酵母菌株中提取Sdc基因；经过PCR聚合酶链式反应扩增Sdc基因；Ⅱ、制作含有Sdc基因的重组质粒；对PCR扩增后Sdc基因及载体质粒进行双酶切，并在DNA连接酶作用下16℃过夜培养，其中Sdc基因与载体质粒的体积比为3:1；Ⅲ、构建Sdc大肠杆菌表达菌株，诱导表达；将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养；Ⅳ、超声破碎Sdc大肠杆菌，纯化水杨酸脱羧酶；对Sdc大肠杆菌的二级种子液进行-80℃冰浴超声破碎制得粗酶液，其中，在100W条件下超声破碎3s，间歇3s，重复200个循环；粗酶液经0.45μm滤膜过滤，后通过镍柱纯化、透析得到水杨酸脱羧酶的精酶液；Ⅴ、设置反应箱及反应体系；利用质谱法计算酶活；向反应箱中添加反应体系，包括1LPBS缓冲液、0.6～0.8g/L精酶液、0.1～0.3g/L氯化亚铁及18～25g/L底物4-氨基水杨酸，并使反应体系的pH为4.0～5.0，温度为25～30℃；反应箱的上端设置排气口，排气口内安装抽气泵，将反应箱内的气体抽到外部环境中。进一步地，质谱法计算酶活的方法为：使用质谱分别测量单位体积下酶解前、后4-氨基水杨酸的含量，按照公式②计算酶活；其中，反应消耗的底物量为反应前测量的4-氨基水杨酸含量减去反应后剩余的4-氨基水杨酸含量；酶含量为水杨酸脱羧酶的含量，经10％SDS-PAGE电泳及Bradford法测得。进一步地，丝孢酵母为丝孢酵母TrichosporonmoniliiformeWU-0401。进一步地，-80℃冰浴通过将常温水在-80℃冰箱中放置过夜制得。进一步地，Sdc大肠杆菌二级种子液的制备方法为：将固体培养基上的Sdc大肠杆菌先接种到10ml的LB液体培养基中，并在LB液体培养基中加入100μg/ml的氨苄西林，37℃，12000r/min的摇床上培养12小时制成一级种子液；按照10％的接种量将一级种子液接种到800ml含有100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中，37℃，12000r/min的摇床上震荡培养6小时制成二级种子液。本专利技术取代传统降解4-氨基水杨酸需经高温的技术条件，使分解反应更易进行且能耗更低、降解效率更高；利用基因工程使水杨酸脱羧酶的应用工业化，提高单位时间内的代谢产量；配制代谢效率最高的反应体系，反应体系中加入的氯化亚铁，在反应箱上设置抽气泵，可提高酶反应活性，并且防止逆反应的发生，提升分解效率；质谱法测量酶活相比现有技术的比色法更加准确。附图说明图1为本专利技术的步骤流程图。图2为不同pH对酶活的影响。图3为不同温度对酶活的影响。图4为不同金属离子及EDTA对酶活的影响。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1所示的一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法，包括以下步骤：Ⅰ、提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因；在LB液体培养基中活化丝孢酵母并从丝孢酵母菌株中提取Sdc基因；丝孢酵母为丝孢酵母TrichosporonmoniliiformeWU-0401，该种丝孢酵母可以代谢水杨酸脱羧酶，水杨酸脱羧酶对4-氨基水杨酸具有脱羧生成间氨基酚；将水杨酸脱羧酶Sdc基因经过PCR聚合酶链式反应扩增Sdc基因，以制备大量的水杨酸脱羧酶。Ⅱ、制作含有Sdc基因的重组质粒；对PCR扩增后Sdc基因及载体质粒进行双酶切，并在DNA连接酶作用下16℃过夜培养，其中Sdc基因与载体质粒的体积比为3:1；依靠基因工程手段将Sdc基因整合到质粒基因上，依靠质粒对大肠杆菌的转化作用使Sdc基因在大肠杆菌中表达。Ⅲ、构建Sdc大肠杆菌表达菌株，诱导表达；将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养；Ⅳ、超声破碎Sdc大肠杆菌，纯化水杨酸脱羧酶；对Sdc大肠杆菌的二级种子液进行-80℃冰浴超声破碎制得粗酶液，其中，在100W条件下超声破碎3s，间歇3s，重复200个循环；粗酶液经0.45μm滤膜过滤，后通过镍柱纯化、透析得到水杨酸脱羧酶的精酶液；制得精酶液中蛋白含量经10％SDS-PAGE电泳及Bradford法测得为0.732mg/mL。超声可以将大肠杆菌破碎，从而释出内容物，其中就包括表达的水杨酸脱羧酶。由于在超声破碎的过程中会使温度升高，为了防止升高的温度使水杨酸脱羧酶变性，因此使用冰浴法，以保证温度不会因超声而升高。进一步的，-80℃冰浴通过将常温水在-80℃冰箱中放置过夜制得，使冰浴的温度相比-20℃或0℃的冰更加耐用，可以减少换冰次数，降低操作复杂度。其次，Sdc大肠杆菌二级种子液的制备方法为：将固体培养基上的Sdc大肠杆菌先接种到10ml的LB液体培养基中，并在LB液体培养基中加入100μg/ml的氨苄西林，37℃，12000r/min的摇床上培养12小时制成一级种子液；按照10％的接种量将一级种子液接种到800ml含有100μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中，37℃，12000r/min的摇床上震荡培养6小时制成二级种子液。二级种子液相比一级种子液具有更高的菌种活性、生长速率更快，可在短时间内达到稳定期，使大肠杆菌菌体数量高、表达蛋白的活性强，可以积累的水杨酸脱羧酶含量最高。Ⅴ、设置反应箱及反应体系；向反应箱中添加反应体系，包括1LPBS缓冲液、0.6～0.8g/L精酶液、0.1～0.3g/L氯化亚铁及18～25g/L底物4-氨基水杨酸，并使反应体系的pH为4.0～5.0，温度为25～30℃；反应箱的上端设置排气口，排气口内安装抽气泵，将反应箱内的气体抽到外部环境中。根据公式①所示，4-氨基水杨酸经脱羧反应生成间氨基酚和二氧化碳，且反应可逆。其中生成的二氧化碳气体会排放在空气中，部分与水结合生成碳酸，碳酸的水解与生成是相互平衡可逆的，在密闭的反应箱中设置抽气泵，一方面可以促进反应箱中的二氧化碳及时排出，降低反应箱内压强，减少二氧化碳溶解；另一方面是反应箱中二氧化碳的含量减少，为了保持平衡，4-氨基水杨酸的分解反应会向分解方向促进，从而防止逆反应发生，使分解完全。在确立反应体系之前，本专利技术测量了不同条件下的酶活，以确定酶解4-氨基水杨酸的效果最佳，其中包括：(1)酶活的测量方法：使用质谱法分别测量单位体积下酶解前、后4-氨基水杨酸的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酶法降解4‑氨基水杨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：Ⅰ、提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因；在LB液体培养基中活化丝孢酵母并从丝孢酵母菌株中提取Sdc基因；经过PCR聚合酶链式反应扩增Sdc基因；Ⅱ、制作含有Sdc基因的重组质粒；对PCR扩增后Sdc基因及载体质粒进行双酶切，并在DNA连接酶作用下16℃过夜培养，其中Sdc基因与载体质粒的体积比为3:1；Ⅲ、构建Sdc大肠杆菌表达菌株，诱导表达；将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养；Ⅳ、超声破碎Sdc大肠杆菌，纯化水杨酸脱羧酶；对Sdc大肠杆菌的二级种子液进行‑80℃冰浴超声破碎制得粗酶液，其中，在100W条件下超声破碎3s，间歇3s，重复200个循环；粗酶液经0.45μm滤膜过滤，后通过镍柱纯化、透析得到水杨酸脱羧酶的精酶液；Ⅴ、设置反应箱及反应体系；利用质谱法计算酶活；向反应箱中添加反应体系，包括1L PBS缓冲液、0.6～0.8g/L精酶液、0.1～0.3g/L氯化亚铁及18～25g/L底物4‑氨基水杨酸，并使反应体系的pH为4.0～5.0，温度为25～30℃；反应箱的上端设置排气口，排气口内安装抽气泵，将反应箱内的气体抽到外部环境中。...

【技术特征摘要】
1.一种酶法降解4-氨基水杨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：Ⅰ、提取并扩增水杨酸脱羧酶Sdc基因；在LB液体培养基中活化丝孢酵母并从丝孢酵母菌株中提取Sdc基因；经过PCR聚合酶链式反应扩增Sdc基因；Ⅱ、制作含有Sdc基因的重组质粒；对PCR扩增后Sdc基因及载体质粒进行双酶切，并在DNA连接酶作用下16℃过夜培养，其中Sdc基因与载体质粒的体积比为3:1；Ⅲ、构建Sdc大肠杆菌表达菌株，诱导表达；将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中，37℃过夜培养；Ⅳ、超声破碎Sdc大肠杆菌，纯化水杨酸脱羧酶；对Sdc大肠杆菌的二级种子液进行-80℃冰浴超声破碎制得粗酶液，其中，在100W条件下超声破碎3s，间歇3s，重复200个循环；粗酶液经0.45μm滤膜过滤，后通过镍柱纯化、透析得到水杨酸脱羧酶的精酶液；Ⅴ、设置反应箱及反应体系；利用质谱法计算酶活；向反应箱中添加反应体系，包括1LPBS缓冲液、0.6～0.8g/L精酶液、0.1～0.3g/L氯化亚铁及18～25g/L底物4-氨基水杨酸，并使反应体系的pH为4.0～5.0，温度为25～30℃；反应箱的上端设置排气口，排气口内安装抽气泵，将反应箱内的气体抽到外部环境中。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡彦营，张爱民，李薇，韩小龙，杨永涛，
申请(专利权)人：济宁学院，
类型：发明
国别省市：山东,37