一种利用海洋细菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用海洋细菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法，涉及海洋微生物发酵技术领域。本发明专利技术以海洋细菌水生黄杆菌（Flavobacterium mizutaii）为出发菌株，通过种子液的制备、种子液扩大培养、发酵产酶培养、发酵液的提取这几个步骤获得了褐藻酸裂解酶粗酶液。本发明专利技术针对水生黄杆菌的产酶规律，对发酵条件和发酵培养基进行了优化试验，通过碳源补料策略以及添加多种产酶诱导物质的方法有效提高了水生黄杆菌的产酶能力，为今后褐藻酸裂解酶的大规模生产提供了重要的技术参数指导。

A method of producing alginate lyase by fermentation of marine bacteria

【技术实现步骤摘要】
一种利用海洋细菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法
本专利技术属于生物工程领域，涉及微生物发酵工艺，尤其涉及一种利用海洋细菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法。
技术介绍
海洋蕴含了丰富的生物质资源，是人类食品、医药等的重要来源。我国海洋资源丰富，是世界上海洋藻类养殖及加工利用规模最大的国家，海藻产量约占世界总产量的60%，超过了1300万吨。褐藻是海洋中含量丰富的经济类海藻，代表植物包括海带、鹿角菜、巨藻和马尾藻等。褐藻酸又名海藻酸、藻酸、海藻素等，是褐藻细胞壁及细胞间质中的一种水溶性酸性多糖，由两种互为C5差向异构体的单体（β-D-甘露糖醛酸、α-L-古罗糖醛酸）聚合而成。褐藻酸结构复杂，物化性质多样，由于其具有金属螯合和高粘滞性能，常作为稳定剂、增稠剂和乳化剂广泛应用于食品、化工和制药等领域。褐藻酸也具有生物活性，如β-D-甘露糖醛酸能诱导单核细胞分泌细胞因子，相反α-L-古罗糖醛酸能抑制白细胞分泌白介素和肿瘤坏死因子，在提高机体免疫力和治疗免疫疾病等方面有良好的用途。作为海藻工业的主体产品，虽然褐藻酸己广泛应用于多个领域，但在生产加工技术、综合利用水平、产业化程度、产品种类及质量上与国外相比还有较大差距，仍主要停留在初级加工阶段，产品附加值低，因此开展新工艺、新技术、新产品的研究与开发是实现海藻生物资源高值化利用的关键。近年来，随着海洋药物和海洋保健制品的蓬勃发展，海洋多糖及其降解产物的研究也引起了广泛的重视。褐藻酸降解产物——褐藻寡糖具有良好生物活性和药用价值，是目前研究最受关注的海洋活性物质之一。褐藻寡糖不仅具有褐藻酸大分子的某些功能性质，而且具有很多褐藻酸所不具备的独特的生理活性和功能特性。在食品工业里，褐藻寡糖作为食品材料或添加剂应用甚广；在造纸工业里，用水溶性的褐藻寡糖代替部分松香，能增加纸的光泽和光滑度，提高其耐揉性；在农业领域，褐藻寡糖可用作农作物的杀螨剂和农药的稳定剂，调节剂等，还能促进植物生长和诱导抗逆性等。此外，褐藻寡糖还广泛应用于冶金、石油、日用化工等各个领域。依其生物活性，褐藻寡糖具有整肠、解毒、降血糖血脂、抗炎、抗菌、抗肿瘤、免疫调节等作用，可作为糖尿病、肥胖症、直肠结肠癌、习惯性便秘患者的疗效食品。此外，寡糖药物的开发也越来越多，可用于心脑血管疾病和病毒方面的药用研究。褐藻寡糖的生产可以采用物理法、化学法和酶解法。其中物理法操作复杂，降解条件难以控制；化学法往往存在目标寡糖的产量低、回收率低和污染环境等问题。而酶解法具有专一性强，条件温和，降解过程及产物分子质量易控制，褐藻寡糖活性高并且对环境无污染的特点，已逐渐成为褐藻寡糖生产最有潜力的生产方式。褐藻酸裂解酶是一类多糖裂解酶，通过β消除反应切断β-1，4糖苷键将褐藻酸大分子降解成低分子量的褐藻寡糖或单糖。由于尚未发现能够作用于褐藻酸的水解酶，因此，褐藻酸裂解酶是目前唯一有效的褐藻酸降解酶类。褐藻酸裂解酶来源广泛，存在于海洋动物、海洋藻类以及微生物中，其中产褐藻酸裂解酶的微生物种类复杂，分布广泛，是目前研究最多的。已报道的产褐藻酸裂解酶的海洋细菌有光合细菌、弧菌、棒杆菌、黄杆菌、假平胞菌、交替单胞菌、假单胞菌、假交替单胞菌等，此类细菌以褐藻酸为碳源和能源之一，有的甚至以褐藻酸为唯一碳源，褐藻酸的存在可以诱导细菌产酶。土壤细菌中产褐藻酸裂解酶的大多是革兰氏阴性菌，已报道的有固氮菌、肠杆菌、克雷伯氏菌等，革兰氏阳性菌产褐藻酸裂解酶报道很少，有芽抱杆菌和梭菌。可能因为生长环境的不同，土壤细菌与海洋细菌所产褐藻酸裂解酶在酶学性质、底物特异性等方面都有很大不同，具有一些特殊的性质。褐藻酸裂解酶作为一种重要的海洋生物酶，有着广泛的生物学功能和应用。褐藻酸裂解酶除了用于制备功能性褐藻寡糖外，还用于降解海藻废物制备乙醇燃料、制备原生质体以及提取海藻植物DNA等。海藻细胞中褐藻多糖的粘度很大，很难将DNA、单细胞、原生质体和胞内活性物质分开，利用裂解酶可使褐藻酸很快降解，粘度下降，方便这些物质的提取。作为海藻解壁酶，这种海藻细胞分离作用大大排除了海藻遗传工程研究的障碍，推动了海藻遗传工程的发展。在医学上，海藻酸裂解酶早已作为药品酶用于治疗由致病菌（Pseudomonasaergenes）引起的慢性疾病。然而，现有的褐藻酸裂解酶普遍存在酶活力较低、酶稳定性较差、酶与产物结合紧密、分离困难等问题，这些缺点限制了褐藻酸裂解酶的推广应用。目前，我国对褐藻酸裂解酶的研究比较基础，国内外的研究也主要集中于菌种分离、基因工程菌的构建及酶学性质的改善、酶解产物的构效等方面，而有关褐藻酸裂解酶的发酵工艺的研究报道很少，褐藻酸裂解酶工业用酶的缺乏成为褐藻与褐藻酸高值化加工的瓶颈。发酵培养基的成分及条件的优化是提高褐藻胶裂解酶活性、降低成本、缩短发酵时间的重要手段之一。因此寻找高产酶的菌株、对产酶菌株进行发酵优化以提升酶活性就显得尤为重要。有鉴于此，本专利技术人研究和设计了一种利用海洋细菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法，本案由此产生。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的、操作简单、产酶效果好的海洋细菌水生黄杆菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的：一种利用海洋细菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法，其特征在于，所述海洋细菌为水生黄杆菌（Flavobacteriummizutaii），来源于海洋微生物菌种保藏管理中心MCCC，保藏编号1A08665，所述方法包括如下步骤：S1、种子液的制备：将水生黄杆菌活化后接入种子培养基中，500mL三角瓶中装液量为100mL，温度28±2℃，转速150-180r/min，摇床振荡培养10-12h；取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；S2、种子液扩大培养：按种子罐容积的30-40%投入种子培养基，121℃高压蒸汽灭菌20-30min，冷却至30℃以下后，将种子液以1%-3%的接种量接入种子培养基中，28±2℃培养14-16h，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；S3、发酵产酶培养：按发酵罐容积的40-50%投入发酵培养基，121℃高压蒸汽灭菌20-30min，冷却至30℃以下后，将步骤S2得到的种子液以4%-6%的接种量接入发酵培养基中，分别在发酵的第10、20、30、40h补加浓度为2g/L的褐藻酸钠溶液1L，整个发酵培养时间为44-48h，获得含有褐藻酸裂解酶的发酵液；S4、发酵液的提取：取发酵液在4℃、13000r/min的条件下离心10min除菌体，向上清液中缓慢加入硫酸铵至80%饱和度，4℃静置3h，然后在4℃、13000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，沉淀溶于20mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）中，4℃透析过夜，再次在4℃、13000r/min的条件下离心10min，取上清液即获得褐藻酸裂解酶粗酶液。步骤S1中，所述菌株活化的方法为：将低温冷冻保藏的水生黄杆菌菌株解冻后，划线接种于2216E固体培养基上，在28℃恒温培养24h。步骤S1与S2中，所述种子培养基的配方为：葡萄糖5-7g/L，蛋白胨5-7g/L，酵母浸粉2-4g/L，NaCl27-33g/L，KH2PO43.6-4.4g本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用海洋细菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法，其特征在于，所述海洋细菌为水生黄杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种利用海洋细菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法，其特征在于，所述海洋细菌为水生黄杆菌（Flavobacteriummizutaii），来源于海洋微生物菌种保藏管理中心MCCC，保藏编号1A08665，所述方法包括如下步骤：S1、种子液的制备：将水生黄杆菌活化后接入种子培养基中，500mL三角瓶中装液量为100mL，温度28±2℃，转速150-180r/min，摇床振荡培养10-12h；取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；S2、种子液扩大培养：按种子罐容积的30-40%投入种子培养基，121℃高压蒸汽灭菌20-30min，冷却至30℃以下后，将种子液以1%-3%的接种量接入种子培养基中，28±2℃培养14-16h，取培养物进行镜检，确认菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；S3、发酵产酶培养：按发酵罐容积的40-50%投入发酵培养基，121℃高压蒸汽灭菌20-30min，冷却至30℃以下后，将步骤S2得到的种子液以4%-6%的接种量接入发酵培养基中，分别在发酵的第10、20、30、40h补加浓度为2g/L的褐藻酸钠溶液1L，整个发酵培养时间为44-48h，获得含有褐藻酸裂解酶的发酵液；S4、发酵液的提取：取发酵液在4℃、13000r/min的条件下离心10min除菌体，向上清液中缓慢加入硫酸铵至80%饱和度，4℃静置3h，然后在4℃、13000r/min的条件下离心10min，弃去上清液，沉淀溶于20mmol/L磷酸盐缓冲液（pH7.5）中，4℃透析过夜，再次在4℃、13000r/min的条件下离心10min，取上清液即获得褐藻酸裂解酶粗酶液。2.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法，其特征在于，步骤S1中，所述菌株活化的方法为：将低温冷冻保藏的水生黄杆菌菌株解冻后，划线接种于2216E固体培养基上，在28℃恒温培养24h。3.根据权利要求1所述的一种利用海洋细菌发酵产褐藻酸裂解酶的方法，其特征在于，步骤S1与S2中，所述种子培养基的配方为：葡萄糖5-7g/L，蛋白胨5-7g/L，酵母浸粉2-4g/L，NaCl27-33g/L，KH2PO43.6-4.4g/L，MgSO4·7H2O0.5-0.7g/L，FeSO4·7H2O0.01-0.02g/L，葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学花，
申请(专利权)人：张学花，
类型：发明
国别省市：江苏,32