裂解酶以及不对称合成(S)‑苯基乙酰基甲醇的方法技术

本发明专利技术涉及裂解酶以及用于不对称合成(

Lyase and asymmetric synthesis (S) method l-phenylacetyl carbinol

The present invention relates to cleaving enzymes and to asymmetric synthesis

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】裂解酶以及不对称合成(S)-苯基乙酰基甲醇的方法本专利技术涉及裂解酶以及不对称合成(S)-苯基乙酰基甲醇的方法。(S)-苯基乙酰基甲醇是有机合成中有价值的手性单元并且可用于合成精细化学品和药物。根据迄今的现有技术，并不已知能够借助不对称合成由非手性的廉价化合物以>89%ee的光学纯度生成(S)-苯基乙酰基甲醇(S)-PAC的方法。但是，在制备精细化学品或药物时，高的光学纯度是极其重要的。根据现有技术已知制备(S)-苯基乙酰基甲醇的各种方法。一方面，已知化学合成。基于化学不对称合成的(S)-PAC制备方法生成68%或86%的ee。这些方法描述在出版物Davis,FranklinA.;Sheppard,AureliaC.;Lal,G.SankarTetrahedronLetters,1989,第30卷,7第779-782页和Adam,Waldemar;Fell,RainerT.;Stegmann,VeitR.;Saha-Moeller,ChantuR.JournaloftheAmericanChemicalSociety,1998,第120卷,4第708-714页中。此外，还有仅作为副产物产生(S)-PAC且(R)-PAC以对映体过量形式存在的方法，这例如通过下列反应，例如描述在出版物Toukoniitty,Esa;Maeki-Arvela,Paeivi;Kuzma,Marek;Villela,Alexandre;KalantarNeyestanaki,Ahmad;Salmi,Tapio;Sjoeholm,Rainer;Leino,Reko;Laine,Ensio;Murzin,DmitryYu,JournalofCatalysis,2001,第204卷,2第281-291页中的1-苯基丙-1,2-二酮的还原和描述在Fleming,StevenA.;Carroll,SeanM.;Hirschi,Jennifer;Liu,Renmao;Pace,J.Lee;Redd,J.TyTetrahedronLetters,2004,第45卷,17第3341-3343页中的由苯甲醛起始的合成和描述在Brussee,J.;Roos,E.C.;Gen,A.VanDerTetrahedronLetters,1988,第29卷,35第4485-4488页中的2-羟基-2-苯基乙腈的反应。此外，描述了手性单元1-苯基丙-1,2-二醇可以氧化成(S)-PAC的合成。(S)-PAC以91%的对映体过量产生，如由Zi-QiangRong,Hui-JiePan,Hai-LongYan和YuZhaoOrganicLetters,2014,16(1),第208–211页描述，或69%的对映体过量，如由WaldemarAdam,ChantuR.Saha-Moeller和Cong-GuiZhaoJournalofOrganicChemistry,64(20),7492-7497;1999描述，但是此外被必须复杂分离出的区域异构体污染。此外，已知描述在ÁlvaroGómezBaraibar于2013年的题为“Developmentofabiocatalyticproductionprocessfor(S)-alpha-hydroxyketones”博士论文中的酶促不对称合成。如果将根据该博士论文的这种在大肠杆菌中异源表达的酶用于在全细胞中合成，(S)-PAC的光学纯度为~43%ee。(S)-PAC的这个唯一的酶促不对称合成描述在由苯甲醛和乙醛或苯甲醛和丙酮酸起始的碳连接反应中。该反应由酶，即来自巴氏醋杆菌的丙酮酸脱羧酶的变体ApPDC-E469G催化，其中在位置号469中的谷氨酸被甘氨酸替换。在此通过分离的酶实现的最高对映体过量为89%，如由出版物RotherNeeGocke,Doerte;Kolter,Geraldine;Gerhards,Tina;Berthold,CatrineL.;Gauchenova,Ekaterina;Knoll,Michael;Pleiss,Juergen;Mueller,Michael;Schneider,Gunter;Pohl,Martina,ChemCatChem,2011,第3卷,10第1587-1596页描述。由现有技术出发，本专利技术的目的是提供不对称合成(S)-苯基乙酰基甲醇的替代性酶促方法，其实现(S)-苯基乙酰基甲醇的高对映体过量。在用全细胞制备时，对映体过量应大于43%。此外，不应形成副产物和区域异构体。在此，应能够使用非手性的廉价反应物。应实现(S)-苯基乙酰基甲醇的不对称合成。应防止手性产物混合物的昂贵分离。应提供可以用于由苯甲醛和丙酮酸或乙醛制备(S)-苯基乙酰基甲醇的酶，以及编码该酶的DNA。此外应提供制备该酶的方法。应克服现有技术中存在的缺点和问题。应提供制备(S)-苯基乙酰基甲醇的方法，其甚至在使用粗细胞提取物（Rohzellextrakt）或全细胞时实现高对映体过量。应累积地克服现有技术的缺点。由权利要求1的上位概念和从属权利要求出发，所述目的根据本专利技术通过在权利要求的特征部分中给出的特征来实现。该目的根据本专利技术通过裂解酶ApPDC-E469G的变体来实现，在该变体的位置号468中的异亮氨酸被具有相对于异亮氨酸减小的占据空间的氨基酸替换。此外，通过根据从属权利要求将裂解酶用于使苯甲醛与丙酮酸或乙醛反应成(S)-苯基乙酰基甲醇，实现该目的。通过本专利技术的裂解酶以及(S)-苯基乙酰基甲醇的制备方法，现在可以在使用全细胞时以93%ee和在使用粗细胞提取物时以85%ee制备(S)-苯基乙酰基甲醇。不形成副产物，特别是不产生区域异构体。由于该合成用非手性反应物也可实现，其是廉价的。可以免除对映体的分离。在制备(S)-苯基乙酰基甲醇时，也可以通过粗细胞提取物或全细胞实现高对映体过量。累积地消除根据现有技术描述的所有缺点。本专利技术的有利的扩展实施方案在从属权利要求中给出。根据本专利技术提供裂解酶，其中在相对于巴氏醋杆菌野生型修饰的蛋白ApPDC-E469G中在位置号468中的异亮氨酸被比异亮氨酸较不占空间的氨基酸置换。该裂解酶对于在制备(S)-苯基乙酰基甲醇时提高立体选择性而言具有有利影响。优选地，可以提及满足这些要求的下列裂解酶：-根据序列号1在位置号468中具有甘氨酸的ApPDC-E469G-I468G-根据序列号2在位置号468中具有丙氨酸的ApPDC-E469G-I468A-根据序列号3在位置号468中具有缬氨酸的ApPDC-E469G-I468V。为了改进对映体过量，也可以在制备(S)-苯基乙酰基甲醇时使用酶ApPDC-E469G-I468L、ApPDC-E469G-I468T、ApPDC-E469G-I468C或ApPDC-E469G-I468S。此外，提供编码所述酶的本专利技术的脱氧核糖核酸。根据本专利技术，这是编码酶ApPDC-E469G的变体的脱氧核糖核酸，其在位置号1402至1404中编码相对于异亮氨酸具有减小的占据空间的氨基酸。对于在所述位置中编码氨基酸甘氨酸的根据序列号1的实例，可以在位置号1402-1404中例如存在核酸GGT。例如，描述了根据序列号4的编码根据序列号1的在本文档来自技高网...

【技术保护点】
裂解酶，其特征在于，在相对于巴氏醋杆菌野生型修饰的蛋白ApPDC‑E469G中在位置号468中的氨基酸异亮氨酸被比异亮氨酸较不占空间的氨基酸置换。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.16 DE 102014013642.61.裂解酶，其特征在于，在相对于巴氏醋杆菌野生型修饰的蛋白ApPDC-E469G中在位置号468中的氨基酸异亮氨酸被比异亮氨酸较不占空间的氨基酸置换。2.根据权利要求1的裂解酶，其特征在于，其具有根据序列1、2或3之一的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2的裂解酶，其特征在于，在位置号543中的氨基酸此外被比色氨酸较小占据空间的氨基酸替换。4.根据权利要求3的裂解酶，其特征在于，其具有根据序列9至47之一的氨基酸序列。5.编码根据权利要求1或2的裂解酶的脱氧核糖核酸，其特征在于，其编码酶ApPDC-E469G的变体，其中位置号1402-1404中的密码子被编码比异亮氨酸较不占空间的氨基酸的密码子替换。6.编码根据权利要求3或4的裂解酶的脱氧核糖核酸，其特征在于，其编码酶ApPDC-E469G的变体，其中位置号1402-1404中的密码子被编码比异亮氨酸较不占空间的氨基酸的密码子替换，且其中此外位置号1627至1629中的密码子被编码比色氨酸较不占空间的氨基酸的密码子替换。7.根据权利要求5或6之一的脱氧核糖核酸，其特征在于，其具有根据序列4或48的核苷酸序列。8.载体，其特征在于，其包含根据序列4或48的脱氧核糖核酸。9.根据权利要求8的载体，其特征在于，其是质粒。10.根据权利要求9的载体，其特征在于，根据权利要求8的序列连接在选自pET-20b(+)、pET-21a-d(+)、pET-22b(+)、pET-23a-d(+)、pET-24a-d(+)、pET-...

【专利技术属性】
技术研发人员：D罗瑟，M波尔，T塞尔，L马克斯，R韦斯特法尔，
申请(专利权)人：于利奇研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE