本发明专利技术提供催化活性显著提高的FSAA突变体及其核苷酸序列，以及含有相应突变体基因的重组表达载体和基因工程菌，通过这些FSAA突变体或含有相应突变体蛋白的基因工程菌不对称催化肉桂醛/α‑溴肉桂醛/4‑硝基肉桂醛/吡啶‑2‑甲醛和羟基丙酮(HA)的羟醛缩合反应可制备高光学纯度的手性产物，后者可作为有价值的手性砌块，在医药领域具有重要的潜在应用价值。
【技术实现步骤摘要】
D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用和反应产物
本专利技术属于基因工程与酶工程领域，具体涉及D-果糖-6-磷酸醛缩酶A的分子改造，获得突变体、重组表达载体，基因工程菌以及不对称催化肉桂醛/α-溴肉桂醛/4-硝基肉桂醛/吡啶-2-甲醛和羟基丙酮(HA)的羟醛缩合反应以制备光学活性产物中的应用。
技术介绍
不对称直接羟醛缩合反应是一类非常重要的C-C加成反应。其产物为天然多羟基化合物或全新的多羟基小分子。由于羟基能够轻易被转换为多种其他功能基团，这些多羟基小分子成为最重要的手性砌块之一，尤其是在医药领域具有重要的应用价值。这其中，(3S,4R,E)-3,4-二羟基-6-苯基-5-己烯-2-酮(3a,式1)是从头合成C-苯基-β-L-古洛糖苷和C-苯基-α-L-甘露糖苷的重要手性前体。后两者是糖苷酶和糖基转移酶的有效抑制剂，具备潜在的抗细菌、抗肿瘤和抗真菌的能力，因此3a的不对称合成具有重要的药用价值。当前3a的合成路径主要依赖于化学催化的肉桂醛和羟基丙酮的羟醛缩合反应。涉及到的催化剂多为硼化物、钛化合物、手性叔胺、NaOH和铟-硝化汞复合体系，转化率相对较高，但是立体选择性不足。由于该反应生成了两个新的功能性手性中心，对该反应手性化学的绝对控制便显得尤为重要。因此，肉桂醛和羟基丙酮缩合的高立体选择性是化学催化该反应的主要障碍。从另一方面而言，生物催化因具有催化效率高、选择性好、副产物少和反应条件温和等优点而成为绿色化学合成的优选途径。这其中，醛缩酶作为一类能够天然催化羟醛缩合反应的催化剂，具有很高的催化效率和立体选择性，因此可作为不对称合成(3S,4R)-3a的首选途径。在具有催化不对称直接羟醛缩合反应能力的醛缩酶中，D-果糖-6-磷酸醛缩酶A(FSAA)能够以非磷酸化的羟基丙酮(HA)、二羟基丙酮(DHA)和羟基丁酮(HB)作为底物，而非相对昂贵且制备较为繁琐的磷酸二羟基丙酮(DHAP)，后者是DHAP依赖型醛缩酶的催化底物。此外，FSAA催化产物具有很高的光学纯度，因此该酶一经报道便获得了广泛的关注。本课题组前期以肉桂醛和HA作为底物筛选醛缩酶，首次发现FSAA具备高立体选择性催化该反应的能力，同时FSAA对肉桂醛类似物，α-溴肉桂醛、对硝基肉桂醛和吡啶-2-甲醛也表现出了相应的催化活力。但是，可能由于肉桂醛及取代肉桂醛结构较为特殊，具有一个与苯环共轭的双键，产生的电子离域效应降低了肉桂醛及取代肉桂醛作为底物的反应活力，导致FSAA催化上述反应的活力远不能满足工业化生产要求，因此，有必要通过相关技术提高该酶的催化效率以充分挖掘其应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是首次以酶分子作为生物催化剂的肉桂醛与HA间的羟醛缩合反应，此外为这些反应提供强有力的生物催化剂，即酶活提高的FSAA的突变体及其重组大肠杆菌。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种催化活性显著提高的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A(FSAA)的突变体。这些突变体是在SEQIDNo:2所示醛缩酶FSAA氨基酸序列基础上进行构建，该醛缩酶核苷酸序列如序列表中SEQIDNo:1所示。具体的，所述突变体是在在SEQIDNo:2所示的氨基酸序列上第59位点谷氨酰胺(Gln59)进行不同的取代。优选的，所述D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体的氨基酸序列选自下列突变序列：SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，第59位突变为亮氨酸(Gln59Leu,即Q59L)；SEQIDNO:6所示的氨基酸序列，第59位突变为苏氨酸(Gln59Thr,即Q59T)。任何对上述突变体氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有醛缩酶活性的，仍属于本专利技术的保护范围。突变体Q59L核苷酸序列如序列表中SEQIDNo:3所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo:4所示；突变体Q59T核苷酸序列如序列表中SEQIDNo:5所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo:6所示。如本领域技术人员所知，本专利技术的FSAA突变体的核苷酸序列也可以是编码序列表中所示氨基酸组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。任何对所示突变体核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有FSAA突变体基因的核苷酸序列。这些重组载体可通过本领域常规方法将本专利技术的FSAA突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-30a。本专利技术还提供一种基因工程菌，可通过将本专利技术的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本专利技术的短链脱氢酶/还原酶突变体基因可以有效表达。本专利技术优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。本专利技术的第五方面提供一种重组FSAA突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本专利技术的重组表达转化体，诱导获得重组FSAA突变体蛋白。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本专利技术的FSAA突变体蛋白的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，pH7.2。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生FSAA突变体蛋白即可。优选下述方法：将本专利技术涉及的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素和氯霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和终浓度为1mg/mL的L-阿拉伯糖的诱导下，即可高效表达本专利技术的重组FSAA突变体蛋白。本专利技术的第六方面提供所述FSAA突变体或其基因工程菌在不对称催化肉桂醛/α-溴肉桂醛/4-硝基肉桂醛/吡啶-2-甲醛和HA的羟醛缩合反应以制备光学活性产物中的应用。具体的，所述的应用为：以肉桂醛(1a)、α-溴肉桂醛(1b)、4-硝基肉桂醛(1c)和吡啶-2-甲醛(1d)和HA为底物，所述FSAA突变体或其基因工程菌为催化剂，30℃下，于pH6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物。具体反应式如下：所述的反应条件可按本领域所用的常规条件进行选择。进一步，所述转化体系中醛底物初始浓度为10～500mmol/L，羟基丙酮初始浓度为50～2500mmol/L。进一步，所述转化体系中FSAA突变体纯酶在反应液中较佳的浓度为0.3～0.6mg/mL。所述转化体系中菌体的质量用量以菌体湿重计为80g/L。进一步，所述反应在pH6.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中进行。进一步，反应体系还可添加1％的二硫苏糖醇(DTT)。进一步，反应体系中的助溶剂可为DMSO或DMF。进一步，反应体系中DMSO或DMF的浓度为10～20％。进一步，所述转化反应液分离纯化方法为：反应结束后，纯酶催化体系中加入3倍体积的甲醇冰浴3h后离心(全细胞催化体系直接离心)，取上清液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，有机层即为含相应产物的粗品，将粗品提纯即获得相本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种D‑果糖‑6‑磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于：所述突变体是在在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列上第59位点谷氨酰胺进行不同的取代。
【技术特征摘要】
1.一种D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于：所述突变体是在在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列上第59位点谷氨酰胺进行不同的取代。2.根据权利要求1所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于，所述D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体的氨基酸序列选自下列突变序列：SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，第59位突变为亮氨酸；SEQIDNO:6所示的氨基酸序列，第59位突变为苏氨酸。3.根据权利要求2所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于，编码所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体的核苷酸序列选自下列序列：SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；SEQIDNO:5所示的核苷酸序列。4.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含编码权利要求1-2任意一项所述的氨基酸序列的核苷酸序列。5.基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌由权利要求4所述的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主微生物为大肠杆菌。7.D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体的制备方法，其特征在于，培养权利要求5或6所述的基因工程菌，诱导获D-果糖-6-磷酸醛缩酶A重组蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：于洪巍，杨小红，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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