碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用。本发明专利技术提供的蛋白质，来源于辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)，是一种碳酸酐酶，命名为XiCA蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明专利技术还保护XiCA蛋白作为碳酸酐酶的应用。本发明专利技术还保护一种碳捕获和储存技术中的应用，其活性成分为XiCA蛋白。本发明专利技术对于相关医疗领域、化工领域等，具有重大的应用前景。

Carbonic anhydrase XiCA and its coding genes and Applications

【技术实现步骤摘要】
碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用。
技术介绍
随着现代工业的发展，二氧化碳浓度的增加造成了全球变暖等不良后果，因此，研究人员提出了多种方案，不仅用于降低CO2的浓度，而且还用于在碳捕获使用和储存方案下回收CO2以再利用。但是在各项方案中，CO2的水合作用是过程中的关键和限速步骤。已报道的物理和化学技术，尽管受到了极大的关注，但因其反应过程有毒且繁琐，并且昂贵的无机催化剂和碱性介质进一步限制发展，而对于酶催化来说，则恰恰相反，酶催化不仅便宜，而且环保节能，因此，基于生物的捕获是具有前景的替代方案。碳酸酐酶(CarbonicAnhydrase，CA，EC4.2.1.1)是可以催化CO2与水、碳酸及氢质子之间可逆反应的锌金属酶。该酶首先在牛红细胞中发现，随后人们陆续从动物，植物，古细菌和真细菌中鉴定出不同的碳酸酐酶，该酶存在五个不同的类型(α，β，γ，δ和ε)；其中α，β，γ三类酶存在于所有原核生物中，具有重要的生理功能，如CO2和离子转运，以及生物合成反应所需的CO2/碳酸氢盐平衡等。另外，碳酸酐酶在几种碳捕获和储存(CCS)技术中具有重要的作用，通过使用碳酸酐酶进行仿生CaCO3矿化的生物技术不仅可行性强而且具有环境友好性，因此，不断的开发研究新来源的碳酸酐酶逐渐成为研究热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供碳酸酐酶XiCA及其编码基因和应用。本专利技术提供的蛋白质，来源于辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)，是一种碳酸酐酶，命名为XiCA蛋白，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)含有(a1)的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有碳酸酐酶功能的由其衍生的蛋白质。(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有碳酸酐酶功能的蛋白质。标签具体如表1所示。表1标签的序列标签残基序列Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRRPoly-His2-10(通常为6个)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDLHA9YPYDVPDYAXiCA蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。所述基因为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)编码区如序列表中序列4中第1-996位核苷酸所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有碳酸酐酶功能蛋白的DNA分子；4)来源于辛芳芳菌，且与1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有碳酸酐酶功能蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。含有所述基因的重组表达载体、表达盒或重组微生物均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护XiCA蛋白作为碳酸酐酶的应用。应用XiCA蛋白作为碳酸酐酶时，采用的温度为20-80℃，采用的pH为3-11。应用XiCA蛋白作为碳酸酐酶时，采用的温度为50℃，采用的pH为5。本专利技术还保护XiCA蛋白在制备碳酸酐酶中的应用。本专利技术还保护一种碳捕获和储存技术中的应用，其活性成分为XiCA蛋白。本专利技术提供的碳酸酐酶XiCA具有较高的酶活力，宽泛的底物，并且反应温度宽泛，反应pH宽泛，对于金属离子、金属离子螯合剂、还原剂、阴离子抑制剂和表面活性剂均具有高耐受性。辛芳芳菌(Xinfangfangiasp.)DLY26已于2019年1月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCCNo：M2019001。本专利技术对于相关医疗领域、化工领域等，具有重大的应用前景。附图说明图1为菌株DLY26的照片。图2为系统发生树。图3为检测最适pH时的相对酶活结果。图4为检测pH稳定性时的相对酶活结果。图5为检测最适反应温度时的相对酶活结果。图6为CaCO3矿化扫描电镜照片。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1、辛芳芳菌DLY26的分离、鉴定和保藏一、分离取约1ml活性污泥样品(取自石化炼油化污水处理系统)，用无菌蒸馏水依次稀释至10倍体积、20倍体积、50倍体积、100倍体积和1000倍体积。采用涂布平板法将100μl稀释后样本涂布于固体培养基表面，30℃培养，每天观察表面菌落的生长情况。挑取颜色不同、形态差异的菌落，通过三区划线法进行纯化和培养，直至在培养基表面生长出能够观察到形态、大小等特征都相同的单菌落为止。二、鉴定将纯化获得的菌株接种于TSA平板，30℃培养24h，然后使用透射电子显微镜观察细胞的形态、大小等特征(菌株DLY26的照片见图1)。从培养24h的TSA平板表面挑取单菌落，按照标准方法进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。制备半固体培养基TSB，采用穿刺接种法观察细菌的运动性和好氧性情况。以液体培养基TSB为基础：配制不同NaCl浓度的培养基体系(NaCl梯度为0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0及9.0g/100mL)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，使用UV-2450分光光度计在OD600处检测细菌的其生长情况，以确定最佳盐度生长范围；配制pH值不同的液体培养基(pH梯度设置为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)，接种后置于30℃的摇床中振荡培养3-5d，以培养条件相同的不接菌培养基作为空白对照，以确定最佳生长pH范围；设置温度梯度为4℃、20℃、28℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃，以确定最佳生长温度范围。以液体碳源培养基为基础，添加浓度的不同碳水化合物作为唯一的碳源，检测细菌的同化作用。参照常见细菌系统鉴定手册中的方法，检测细菌的硝酸盐还原、亚硝酸盐还原能力，反硝化能力以及脂酶、接触酶的有无。使用海博革兰氏阴性细菌鉴定系统(青岛，中国)进行细菌的Voges-Proskauer测试(VP测试)，检测细菌的硫化氢(H2S)产生、脲酶(URE)、明胶(GEL)水解情况。也可以用于评价其他生理生化特征的有无，例如通过对精氨酸(ADH)、山梨醇(SOR)、蔗糖(SAC)等的降解情况，以检验精氨酸酶、山梨醇脱氢酶、蔗糖酶的存在情况。以X.soliZQBWT、R.megalophilusJA194T和Fal.halotoleransJA744T作为参考菌株。菌株DLY26和参考菌株的结果见表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)含有(a1)的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有碳酸酐酶功能的由其衍生的蛋白质。(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有碳酸酐酶功能的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)或(a7)：(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a3)含有(a1)的融合蛋白；(a4)在(a1)的末端连接含有标签的短肽得到的融合蛋白；(a5)在(a1)的末端连接标签得到的融合蛋白；(a6)将(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加具有碳酸酐酶功能的由其衍生的蛋白质。(a7)来源于辛芳芳菌，且与(a1)具有99％以上同源性，且具有碳酸酐酶功能的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白质的编码基因。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：1)编码区如序列表中序...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建国，郗丽君，葛保胜，刘德健，苏石晶，谭雯斐，王佳宇，窦珂，王明，
申请(专利权)人：中国石油大学华东，
类型：发明
国别省市：山东,37