新型荧光素酶及其使用方法技术

本发明专利技术涉及编码新型荧光素酶、其功能片段、同源物和突变体的核酸分子，以及由所述核酸编码的蛋白。感兴趣的核酸分子从真菌中分离或通过基因工程方法获得。此外，本发明专利技术提供了包含所述核酸分子的宿主细胞、稳定细胞系和转基因生物。另外，本发明专利技术提供了本发明专利技术蛋白的特异性抗体。所述蛋白和核酸用于许多应用和方法中，特别是用于标记生物体、细胞、细胞器或蛋白。当测试各种条件下的启动子活性时，所述蛋白和核苷酸组合物也用于检测蛋白‑蛋白相互作用的方法中。最后，本发明专利技术提供了用于在多种方法和应用中使用本发明专利技术蛋白和核酸的试剂盒。

New Luciferase and Its Application

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型荧光素酶及其使用方法专利
本专利技术主要涉及生物学和化学领域，更具体地涉及荧光素酶。
技术介绍
生物发光是指生物有机体或生物分子产生和发光的能力。产生生物发光的能力取决于特定蛋白质的存在：荧光素酶或光蛋白。荧光素酶是催化低分子量化合物氧化的酶(即荧光素)，并将它们转化为氧化荧光素。氧化伴随着光的发射和氧化荧光素的释放。光蛋白也催化荧光素的氧化；然而，在这种情况下，荧光素充当辅基以形成稳定的光蛋白复合物。由光蛋白产生的光量大致与其浓度成比例，而对于荧光素酶，光量取决于酶和荧光素的浓度。在许多情况下，由光蛋白催化的生物发光反应响应于介质中金属离子的释放而被激活。例如，水母光蛋白响应于钙离子的释放而催化荧光素(腔肠素)的氧化，这导致发出短暂的光闪烁。荧光素酶在生物医学和生物技术的许多应用中用作报告基因。特别是，它们用于诊断方法、检测培养基中微生物和毒剂的方法；它们还用于测定各种物质的浓度、用于检测信号级联的激活等[Scott等，AnnuRevAnalChem，2011，4：297-319；Badr和Tannous，TrendsBiotechnol.2011，29：624-33；Andreu等，FEMSMicrobiolRev.2011，35：360-94]。许多应用荧光素酶的方法已经见诸综述[Kaskova等，ChemSocRev.，2016，45：6048-6077；Scott等，AnnuRevAnalChem，2011，4：297-319；Widder和Falls，IEEE量子电子学专题论文，2014,20：232-241]。目前已知几种类型的生物发光系统。已经证明，各种生物在进化过程中独立发育它们超过四十次[Herring，生物发光与化学发光学报，1987,1：147-63；Haddock等，海洋科学年度评论，2010年；2：443-93]。已经描述了来自北美萤火虫(Photinuspyralis)的催化D-荧光素氧化的荧光素酶[deWet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，1985，82：7870-3；deWet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，1987，7：725-37]。D-荧光素的氧化伴随着在560nm处具有发射最大值的黄绿光的释放。同样的D-荧光素被其他昆虫荧光素酶氧化：截至目前，已经克隆了来自假滴虫(Pseudodidae)、金龟子科(Elateridae)和七鳃鳗科(Lampyridae)的各种昆虫物种的30多种酶，其发射的最大发射光在536至630nm范围内。此外，已经描述了昆虫荧光素酶的突变形式，并且已经生产了合成的D-荧光素类似物，使得可以获得具有不同特性的荧光素-荧光素酶对[Thorne等，ChemBiol.，2010，17：646-57]。尽管有各种各样的类似物，但由于反应的高量子效率，D-荧光素仍然是生物体内发光最常见的底物(0.88±0.25[Seliger和McElroy，ArchBiochemBiophys，1960，88：136-141]。使用该系统的一个重要困难是来自北美萤火虫的荧光素酶的分子量较高(61kDa)。这一事实使得它不适合产生几种嵌合蛋白(例如，用于研究病毒)，因为其增加的基因组的稳定性较低[Tran等，JVirol，2013，87：13321-13329；Tran等，Viruses，2015，7：5319-5327]。另一个困难是需要获得对映体纯化形式的D-荧光素，因为其异构体L-荧光素是反应的强竞争性抑制剂[Lembert，BiochemJ，1996，317：273-277]。来自北美萤火虫的荧光素酶不分泌的事实额外限制了在体内生物发光信号的量化。此外，一大组催化腔肠素氧化的荧光素酶和光蛋白已见诸描述。例如，已经描述了海鳃(Renilla)、高西娅(Gaussia)和龙眼甲虫(Metridialonga)中的腔肠素依赖性生物发光系统[O.Shimomura，生物发光：化学原理和方法，世界科学出版有限公司，新加坡，2006，第470页]并被广泛使用。还获得了腔肠素依赖性荧光素酶和光蛋白的突变形式以及腔肠素的合成类似物[Kaskova等，ChemSocRev.，2016，45：6048-6077]。尽管腔肠素系统具有多种优点(即分泌能力、小尺寸和各种可用的荧光素酶)，但是其应用的主要限制主要与生物发光发射最大值的蓝色区域中的位置有关；最终，蓝光主要被感兴趣的组织在体内吸收。此外，生物发光底物本身可以在环境氧的非酶促氧化期间发光(在组织中存在超氧阴离子和过氧亚硝酸根离子增强了该过程)，导致测量的生物发光信号中的噪音。与海洋细菌有关的生物发光系统的另一个例子已见诸描述。该系统与其他生物发光系统明显不同。细菌荧光素(肉豆蔻醛)在反应过程中被氧化，但不是生物发光的发光体[O.Shimomura，生物发光：化学原理和方法，世界科学出版有限公司，新加坡，2006，第470页]。除荧光素外，发光反应的关键组分是NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和FMN-H2(黄素单核苷酸)，其氧化衍生物作为真正的光源。海洋细菌的生物发光系统的应用有限，因为它们仅适用于原核表达系统。具有高反应性荧光素和高度稳定的荧光素酶的介形虫海萤(Cypridina)的生物发光系统也是已知的。[Shimomura等，Science，1969，164：1299-300]。这种生物发光系统的主要缺点之一是海萤(Cypridina)荧光素在空气中的稳定性极低，特别是在杂质存在下。荧光素的生物发光最大值落在448-463nm的范围内(取决于溶液的离子强度)。这一事实使得该系统不适合以未改变的形式在深部组织中体内应用。双鞭毛虫和磷虾的生物发光系统也是已知的。至今，已经克隆了编码该组三种荧光素酶的基因[O.Shimomura，生物发光：化学原理和方法，世界科学出版有限公司，新加坡，2006]。这些系统的显著缺点是缺乏对其的认识：尚未鉴定出完整的荧光素酶序列，并且尚未确定该系统的应用范围。至今，与甲藻和磷虾的生物发光机制相关的知识是不完整的。尽管目前使用多种生物发光系统，仍然需要更多具有新特性的荧光素-荧光素酶对。特别地，能够氧化水溶性细胞渗透性荧光素的不依赖ATP和不依赖NAD(P)H的荧光素酶可能是有利的。在这方面，真菌荧光素酶具有重要意义。真菌生物发光是众所周知的。而且，它在Aristotle的论文中被提及。然而，人们对真菌生物发光系统仍然知之甚少。1959年，Airth和McElroy表明，真菌生物发光系统至少包含热敏成分(即荧光素酶)和非热敏成分(即荧光素)和NAD(P)H[Airth和McElroy，JournalofBacteriology，1959，77：249-50]。2015年，Purtov等人检测到真菌荧光素：它是一种膜透过性分子——3-羟基牛奶树碱(3-hydroxyhispidin)[Purtov等，AngewandteChemie，2015，54：8124-28]。然而，没有克隆真菌荧光素酶。
技术实现思路
本专利技术提供了编码新型荧光素酶及其功能性突变体的分离的核酸分子。所述荧光素酶氧化3-羟基牛奶树碱引起光的发射。所述荧光素酶不依赖于ATP和NAD(P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码荧光素酶或其功能片段的分离的核酸，其特征在于，选自下组：(a)编码蛋白的核酸，所述蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34所示的氨基酸序列基本相同；(b)编码蛋白的核酸，所述蛋白具有与(a)中的氨基酸序列至少60％相同的序列；(c)编码包含共有序列SEQ ID NO：35的蛋白的核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2017.01.30 RU 20171029861.一种编码荧光素酶或其功能片段的分离的核酸，其特征在于，选自下组：(a)编码蛋白的核酸，所述蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32或34所示的氨基酸序列基本相同；(b)编码蛋白的核酸，所述蛋白具有与(a)中的氨基酸序列至少60％相同的序列；(c)编码包含共有序列SEQIDNO：35的蛋白的核酸。2.一种表达盒，其特征在于，包含在宿主细胞中核酸表达所需的调节元件的控制下的如权利要求1所述的核酸分子，所述表达盒被整合到细胞基因组中或以染色体外元件的形式引入细胞中，从而能够表达如权利要求1所述的核酸编码的荧光素酶。3.一种产生由权利要求1所述的核酸编码的荧光素酶的细胞，其特征在于，包含染色体外元件形式或整合到细胞基因组中的元件形式的如权利要求4所述的表达盒。4.一种分离的荧光素酶或其功能片段，其特征在于，选自下组：(a)一种蛋白，所述蛋...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·V·亚姆波尔斯基，
申请(专利权)人：普兰塔有限公司，
类型：发明
国别省市：俄罗斯,RU