编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种种编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab‑MR、其表达载体及其应用，旨在解决抗虫基因在玉米中表达沉默、转基因玉米抗虫性低的技术问题。本发明专利技术设计了一种抗虫基因Cry1Ab‑MR及其克隆引物；进一步设计了一种用于遗传转化的含有抗虫基因Cry1Ab‑MR的原核和真核表达载体；同时构建了出了用于遗传转化的原核和真核表达工程菌。并将抗虫基因、真核表达载体、工程菌在转基因植物中的应用。本发明专利技术首次提供的抗虫基因Cry1Ab‑MR能够在玉米种表达，并能够显著提供玉米叶片的抗虫性，且可避免基因沉默现象的发生，其在提供植物抗虫性具有广阔的应用空间和市场前景。

Cry1Ab-MR gene encoding Bt insecticidal protein, its expression vector and its application

【技术实现步骤摘要】
编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）属于原核生物细菌纲芽孢杆菌科芽孢杆菌属，是一种革兰氏阳性菌。1901年从染病的家蚕体液中被分离出来，发现其对部分鳞翅目昆虫具有毒杀作用。其杀虫原理是：在形成芽孢的过程中，产生了一系列对昆虫具有高度特异性毒杀作用的杀虫蛋白晶体，由于杀虫蛋白晶体自身没有生物活性，被称为原毒素，敏感性昆虫摄取原毒素后，在中肠碱性条件下，原毒素被水解为多肽，这些多肽具有特异的杀虫活性，可与中肠肠道上皮的柱状细胞的特异性受体结合，不可逆地插入质膜中，使细胞膜上形成孔道，进而破坏细胞的离子平衡，最终导致细胞裂解，致使昆虫死亡。因其表达产物Bt毒蛋白杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的转杀虫基因。随着分子生物学技术的发展和基因克隆、DNA操作等技术出现，人类开始从Bt菌中克隆其毒蛋白基因到工程菌中，转基因生物得到迅猛发展。自1987年来，Bt的抗虫基因现已成功转化多种植物中，获得了抗性转基因植株，其中很多已进入大田试验，甚至有的已经开始大面积种植。但是，早先获得的转基因植物的抗虫性很低，毒蛋白的含量也很低，不能满足生产上的实际需求，大多难以应用；随着抗虫基因的大范围应用，昆虫对杀虫蛋白产生抗性；抗虫基因的抗虫谱窄；外源基因在植物体内的表达存在基因“沉默”现象，等等。上述转Bt毒蛋白基因的抗虫植物在应用中的潜在问题日益显露，影响其持续利用。随着植物抗虫基因工程的不断深入，目前在基因修饰与改造、表达载体的构建、植物组织的转化方式、抗虫植物的培育等方面成为重点研究方向，以期能够培育抗虫作物，减少环境污染，保护人类健康。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种种编码Bt杀虫蛋白的基因Cry1Ab-MR、其表达载体及其应用，以解决抗虫基因易在玉米中表达沉默、转基因玉米抗虫性低的技术问题。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：基于长期大量试验和实践经验，设计一种抗虫基因Cry1Ab-MR，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。综合考虑抗虫基因Cry1Ab-MR的各种特性及引物的灵敏度，设计了其克隆引物，其核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3；其核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5。结合实用特性设计出了一种包含上述抗虫基因的原核表达载体。构建一种用于遗传转化的原核表达工程菌，该工程菌包含所述抗虫基因序列。进一步构建了一种用于植物遗传转化的真核表达载体，该载体包含所述的抗虫基因序列。构建一种用于植物遗传转化的工程菌，该工程菌包含所述抗虫基因序列。将所述抗虫基因、所述的真核表达载体、所述的工程菌在转基因植物中的应用。优选的，所述植物为单子叶植物。优选的，所述单子叶植物为玉米。与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果在于：1.本专利技术首次提供了一种抗虫基因Cry1Ab-MR基因的核苷酸序列。2.本专利技术Cry1Ab-MR基因能够在玉米种稳定表达，克服了外源基因在植物体内表达存在的基因沉默现象，并能够显著提高玉米叶片的抗虫性。3.本专利技术Cry1Ab-MR基因、重组表达载体和重组菌在提供植物抗虫性具有广阔的应用空间和市场前景。4.本专利技术将抗虫基因Cry1Ab-MR导入玉米后，可以得到稳定遗传的转化体。此外，该基因也可以转化棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低化学农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。附图说明图1为重组表达载体构建验证电泳图；图1中，1为PET28bNdeI/HindIII双酶切，2为pETCry1Ab-MRNdeI/HindIII双酶切，3为DNAmarkSM0331，4为pETCry1Ab-MR质粒；图2为虫试试验玉米螟大小对比图；图2中，A为试验组，B为对照组，C为空白组；图3为转基因玉米植株Cry1Ab-MR基因PCR产物电泳图；图4为转基因植株Bar基因PCR产物电泳图；图3和4中，M为DL2000Marker；CK1为阳性对照（质粒pCAMBIA3300-Cry1Ab-MR）；CK2为阴性对照（非转基因玉米）；空白为空白对照（双蒸水）；1～6为转基因玉米；图5为玉米转化植株免疫试纸条检测结果图；图5中，1～4为Bt-Cry1Ab/Ac试纸条；1为阴性材料；2～4：转基因材料；5～8为PAT试纸条；5为阴性材料；6～8为转基因材料；图6为转基因玉米植株室内抗虫对比图；图6中，1～2为普通玉米植株叶片；2～4为转Cry1Ab-MR基因玉米植株叶片；图7为转基因植株及对照植株田间抗虫性检测对比图之一；图8为转基因植株及对照植株田间抗虫性检测对比图之二；图7和8中，左图为对照植株，右图为转基因植株。具体实施方式下面结合附图和实施例来说明本专利技术的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的菌株或载体如无特别说明，均为市售常规菌株或载体；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例一：改造抗虫基因Cry1Ab基因专利技术人基于长期大量的试验研究和实践经验，在原始Cry1Ab（GenBank序列号为AY847289.1）抗虫基因的基础上进行了大幅的改进设计，主要包括密码子改造，确认并排除原始抗虫基因DNA序列中多处ATTTA、AATGAA等AT富集区和基因序列中存在的反向重复序列，去掉部分常用限制性内切酶识别位点序列（XbaI），减少了不明确的真核DNA序列内含子的序列和可能引起该基因转录提前终止或引起mRNA不稳定的序列，并在3’端加上终止密码子TAG，最终获得按照单子叶植物编码特征设计了密码子优化的抗虫基因Cry1Ab-MR，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。改造合成的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白Cry1Ab-MR基因，与原始Cry1Ab基因的序列相比较，具有以下特点：（1）改造后的抗虫基因序列消除了原始DNA序列中多处ATTTA、AATGAA等AT富集区和基因序列中存在的反向重复序列。（2）在改造后Cry1Ab-MR基因的1848个碱基中，A碱基含量为19.64%，T碱基含量为16.40%，C碱基含量为34.74%，G碱基含量为29.22%，从而使G+C含量由36.26%提高到63.96%，G+C含量在原来的基础上增加了27.70%；（3）通过DNAMAN软件MultipleAlignment对改造前后抗虫基因进行同源比对分析发现改造的新Bt基因Cry1Ab-MR基因核苷酸序列与原始Bt基因序列同源性仅为65.45%。实施例二：Cry1Ab-MR基因在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达1.原核表达载体的构建（1）以pUC载体为框架，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成含Cry1Ab-MR基因的重组载体，命名为pUC-Cry1Ab-MR；（2）设计克隆引物：上游引物F1：5’-CATATGGACAACAACCCGAACATC-3’；下游引物R1：5’-AAGCTTCTAGTACTCAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种抗虫基因

【技术特征摘要】
1.一种抗虫基因Cry1Ab-MR，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种克隆权利要求1所述抗虫基因Cry1Ab-MR的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3；其核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5。3.一种用于遗传转化的原核表达载体，其特征在于，该载体包含权利要求1所述的抗虫基因Cry1Ab-MR。4.一种用于遗传转化的原核表达工程菌，其特征在于，该工程菌包含权利要求1所述的抗虫基因Cry...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳润清，铁双贵，刘璐，许蒙蒙，陈娜，傅晓雷，郭新海，卢董华，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南,41