本发明专利技术公开了一种人工合成的Bt抗虫基因JBT‑AB及其应用，一种人工合成的Bt抗虫基因JBT‑AB，所述Bt抗虫基因JBT‑AB的核苷酸序列用SEQ ID No 1所示。本发明专利技术人工合成的Bt抗虫基因JBT‑AB可在转化植物中稳定遗传和表达，获得的转基因植物抗虫性效果好。Bt抗虫基因JBT‑AB可以转化玉米等农作物，使其具备相应的抗虫能力，降低农药的使用量，从而减少环境污染。本发明专利技术培育出抗虫植物的方法简单易操作，为提高植物抗虫提供了新的有效选择。
【技术实现步骤摘要】
一种人工合成的Bt抗虫基因JBT-AB及其应用
本专利技术属于抗虫基因工程技术和分子生物学领域，具体涉及一种人工合成的Bt抗虫基因JBT-AB及其应用。
技术介绍
玉米是世界上最重要的粮食作物之一，在我国大部分地区广泛种植，是主要的粮食作物与经济作物，其对保持农业结构稳定乃至粮食安全具有重要作用。玉米螟OstriniafurnacalisGuenée危害玉米植株地上的各个部位，使受害部分丧失功能，降低籽粒产量，是限制玉米产量提升的重要因素，由于其具有发生代数不稳定，钻蛀能力强，药剂不易到达取食位置，抗药性较强等特点，化学方法对玉米螟的防治效果并不理想。同时，现有玉米种质缺少抗虫资源，传统抗性育种途径亦很难取得突破。基因工程技术为解决玉米螟危害提供了重要途径。由于该方法具有安全、有效、可降低投资和减少环境污染等诸多优点,因而,自1987年首次报道抗虫转基因植物以来,植物抗虫基因工程的研究取得了迅猛发展。德国科学家ErnstBerliner在德国苏云金，从患病的地中海粉螟(Ephestiakuehniella)中分离到了苏云金芽孢杆菌，将其命名为Bacillusthuringiensis(Bt)。苏云金芽孢杆菌的毒蛋白基因(简称Bt-toxin)是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因。但是在自然界中，由于Bt基因对靶标昆虫具有特异的毒杀作用，导致靶标昆虫为了生存而产生一些突变来抵抗Bt基因的毒杀，最终导致对Bt基因产生抗性。抗虫基因虽然对人畜无毒，不破坏环境，但目前普遍存在获得的转基因植物抗虫效率低的问题。抗虫基因大多来源于细菌等微生物，其密码子与植物有较大差异，因此，对天然Bt基因进行改造，合成新的抗虫基因，使抗虫基因适合在植物受体细胞中表达，从而提高转基因植株的杀虫性是目前急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种人工合成的Bt抗虫基因JBT-AB。本专利技术的第二个目的是提供人工合成的Bt抗虫基因JBT-AB在制备抗虫植物中的应用。本专利技术的技术方案概述如下：一种人工合成的Bt抗虫基因JBT-AB，所述Bt抗虫基因JBT-AB的核苷酸序列用SEQIDNo1所示。上述人工合成的Bt抗虫基因JBT-AB在制备抗虫植物中的应用。本专利技术的优点：本专利技术人工合成的Bt抗虫基因JBT-AB较其密码子优化前更容易获得稳定表达的转基因植株，获得的转基因植物抗虫性效果好。本专利技术人工合成的Bt抗虫基因JBT-AB为抗虫性基因的应用奠定基础。Bt抗虫基因JBT-AB可以转化玉米等农作物，使其具备相应的抗虫能力，降低农药的使用量，从而减少环境污染。本专利技术培育出抗虫植物的方法简单易操作，为提高植物抗虫提供了新的有效选择，具有应用前景。附图说明图1为JBT-AB基因的植物表达载体。图2为转JBT-AB基因的玉米RT-PCR检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中所用方法如果没有特别的说明，均为常规方法，所用术语和缩写均是本领域技术人员通用的术语和缩写。天塔五号玉米种子购自天津科润津丰种业有限责任公司。本申请以玉米种为例，实验证明，其它植物也可以用于本专利技术。C58农杆菌感受态购自武汉淼灵生物科技有限公司。含有基因Bar的质粒pCAMBIA3301购自武汉淼灵生物科技有限公司。实施例1JBT-AB基因的设计改造根据苏云金芽孢杆菌Cry1Ac蛋白不同区域的活性分析及玉米基因组特点，我们对Cry1Ac蛋白氨基酸序列对应的密码子及编码框进行了优化改造，设计出一条新的基因，命名为JBT-AB。基因JBT-AB中G的含量为22.59％；C的含量为25％；T的含量为2。Bt抗虫基因JBT-AB(简称JBT-AB基因)的核苷酸序列用SEQIDNo1所示。实施例2JBT-AB基因的植物表达载体构建按照实施例1的方案我们合成了JBT-AB基因，同时在基因的5’端添加了BamHI的酶切位点，3’端添加了SalI的酶切位点。用BamHI、SalI对JBT-AB基因进行酶切，并回收JBT-AB基因片段，然后与BamHI、SalI酶切过得的已有植物表达载体pCAMBIA3301进行连接，得到含有JBT-AB基因的植物表达载体pCAMBIA3301-JBT-AB(见图1)。实施例3JBT-AB基因转化农杆菌实验中所用的农杆菌为C58菌株，重组质粒载体pCAMBIA3301-JBT-AB上构建有筛选基因Bar。将保存的C58农杆菌感受态从-80℃冰箱拿出100μL，放在冰上，取出4μLpCAMBIA3301-JBT-AB质粒与农杆菌100μL混匀，冰浴15min，放入冰上预冷的电击杯中，1500V，电击转化。将菌液吸入1.5mL离心管中，加入400μLYEP液体培养基，于28℃振荡培养3h，6000r/min，28℃，离心收集菌体，弃300μL上清，重悬菌体，涂板于28℃暗培养2天，筛选出转化成功的转化用农杆菌单菌落。实施例4农杆菌侵染液的制备从平板上挑取转化用农杆菌单菌落接种于YEP液体培养基中(含100mg/L卡那霉素)，28℃、180r/min振荡培养过夜，当农杆菌生长至对数生长期时(OD600为0.6，20℃，5000r/min离心7min收集菌体，用等体积侵染培养基重悬菌体，得到农杆菌侵染液。YEP培养基：10g/L蛋白胨+10g/L酵母提取物+5g/LNaCl，pH为7.0。侵染培养基：1/2MS+65g/L蔗糖+36.5g/L葡萄糖+150μmol/L乙酰丁香酮，pH为5.3。实施例5转Bt抗虫基因JBT-AB玉米的获得。1玉米芽尖的转化。选取整齐饱满的天塔五号玉米种子，70％酒精浸泡1min，0.1％升汞消毒12min，无菌水清洗3次后接入发芽培养基，26℃，黑暗条件下培养。待苗长至4-6cm时，在无菌条件下切除幼叶和胚芽鞘以露出芽尖生长点，并用灭过菌的手术刀轻轻划伤用于侵染。将玉米芽尖浸泡在农杆菌侵染液中(含有150μmol/L乙酰丁香酮)，并置于真空干燥器中，在50kPa压力下侵染20分钟，侵染完后弃去菌液，用无菌滤纸吸去玉米芽尖表面多余的菌液，继续放入发芽培养基中培养3天，写上得到玉米小苗。发芽培养基：1/2MS+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，pH为5.7。2转化苗的移栽和筛选。洗去玉米小苗根部的培养基，移入装有珍珠岩、蛭石、营养土的体积比为1:2:2的花盆中，放于温室培养。待小苗长到5-7cm时将250mg/L的草胺膦水溶液，10mL/株，喷洒在叶片上进行抗性苗的筛选。3抗性植株的RT-PCR分子检测。用非转基因对照植株叶片和转基因植株叶片(本实施例步骤2获得的叶片)提取总RNA，反转录合成的cDNA作为模板，用JBT-AB特异性引物进行扩增，扩增出的片段大小为1740bp(SEQIDNo：1)。扩增反应程序为:94℃3min；(94℃30s，58℃30s，72℃30s，32个循环)；72℃延伸7min。引物为上游:atgattgatatctctttat(SEQNO.2)；下游:tgtgaccggtatgaactcaa(SEQNO.3)。产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。如图2所示，泳道1为Marker，泳道2-4为转基因植株，5为非转基因对照，6为质粒pCAM本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人工合成的Bt抗虫基因JBT‑AB，其特征是所述Bt抗虫基因JBT‑AB的核苷酸序列用SEQ ID No 1所示。
【技术特征摘要】
1.一种人工合成的Bt抗虫基因JBT-AB，其特征是所述Bt抗虫基因JBT-AB的核苷酸序列用...
【专利技术属性】
技术研发人员：王罡，李倩，季静，袁东，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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