一种人工合成cry1Ah1基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人工合成cry1Ah1基因及其应用，该人工合成cry1Ah1基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示或如SEQ ID NO.3所示。本发明专利技术选取Bt杀虫基因crylAh1基因野生型序列为原始序列对cry1Ah1基因编码区全长起始密码子开始第64nt‑1998nt杀虫关键区域共645个氨基酸，在不改变原有氨基酸一级序列的前提下进行密码子优化，获得cry1Ah1‑B基因和cry1Ah1‑U基因，将优化后的基因与优化前基因的所有基因翻译的蛋白经过tBlastX比较均完全一致。对转cry1Ah1改造基因植株的RT‑PCR鉴定分析，表明cry1Ah1‑B、cry1Ah1‑U与野生cry1Ah1基因表达效率有明显差别，转Bt基因杨树的ELISA测定结果表明，包括对照组在内的所有株系总蛋白量保持在24.013mg/g~26.667mg/g之间，虫试结果较为良好的株系中A‑3‑4、A‑5‑0、A‑5‑23和Z‑1‑3四个株系的毒蛋白含量在4669.38ng/g~9342.33ng/g之间，抗虫效果明显。

【技术实现步骤摘要】
一种人工合成cry1Ah1基因及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种人工合成cry1Ah1基因及其应用。
技术介绍
抗虫转基因植物最重要的就是杀虫蛋白的表达量及活性，由于在进行Bt基因转化植物时，多选用对害虫具有高毒力的基因，并且已知杀虫活性关键区域，在进行基因优化和修饰时不会对基因表达的氨基酸序列做出改变，故不会影响最终杀虫蛋白的活性。所以提高外源抗虫基因在植物中的表达量是转抗虫基因植物基因工程重要研究方向。Bt基因的表达量越高，植物的抗虫效果越好。植物的抗虫性还要受到害虫对植物的侵蚀部位和季节性的影响，综合考虑这些因素以便于实现杀虫基因表达的更好的效果。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种人工合成cry1Ah1基因及其应用。技术方案：为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种人工合成cry1Ah1基因，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。所述的人工合成cry1Ah1基因在表达Bt蛋白中的应用。所述的人工合成cry1Ah1基因在转基因杨树中的应用。一种人工合成cry1Ah1基因，其碱基序列如SEQIDNO.3所示。所述的人工合成cry1Ah1基因在表达Bt蛋白中的应用。所述的人工合成cry1Ah1基因在转基因杨树中的应用。有益效果：与现有技术相比，本专利技术选取Bt杀虫基因crylAh1(64nt-1998nt)基因野生型序列为原始序列对cry1Ah1基因编码区全长起始密码子开始第64nt-1998nt杀虫关键区域共645个氨基酸，在不改变原有氨基酸一级序列的前提下进行密码子优化，获得cry1Ah1-B基因和cry1Ah1-U基因，将优化后的基因与优化前基因的所有基因翻译的蛋白经过tBlastX比较均完全一致。对转cry1Ah1改造基因植株的RT-PCR鉴定分析，表明cry1Ah1-B、cry1Ah1-U与野生cry1Ah1基因表达效率有明显差别，cry1Ah1-U基因mRNA相对水平表达量的均值为0.032556，cry1Ah1-B基因mRNA相对水平表达量的均值为0.004044，野生cry1Ah1基因mRNA相对水平表达量的均值为0.000275。转Bt基因杨树的ELISA测定结果表明，包括对照组在内的所有株系总蛋白量保持在24.013mg/g～26.667mg/g之间，虫试结果较为良好的株系中A-3-4、A-5-0、A-5-23和Z-1-3四个株系的毒蛋白含量在4669.38ng/g～9342.33ng/g之间，占总蛋白表达量的比重是在0.0183％～0.0387％之间，均在0.01％以上。总体而言，毒蛋白表达量越高、占总蛋白表达量越高，越容易使美国白蛾体内毒素累积起到杀虫作用，抗虫效果也就越好。附图说明图1是cry1Ah1优化前后基因tBlastX比较图；图2是试纸条检测Bt蛋白的表达位置结果图；图3是转化南林895杨过程图；图中，A：杨树叶盘；B：抗性芽的筛选；C：抗性愈伤再生小苗；D：再生植株生根；图4是转cry1Ah1-B基因杨树抗性植株基因组PCR检测结果图；图中，M：DNAMarker；CK+：阳性质粒；CK-：非转基因南林895杨；1-15：转基因NL895杨；图5是转cry1Ah1-U基因南林895杨抗性植株基因组PCR检测结果图；图中，M：DNAMarker；CK+：阳性质粒；CK-：非转基因南林895杨；1-15：转基因NL895杨；图6是Bt蛋白标准曲线图；图7是转Bt基因抗虫杨树的ELISA测定结果图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明。以下实施例中，没有做出具体说明的操作，均按照本领域的常规方法或参照分子生物学实验手册进行即可。实施例1根据现有的高频密码子算法对欧洲山杨的92个基因32397个、毛白杨的54个基因共18377个密码子、银白杨和欧洲山杨所得杂交杨11个基因共1918个密码子、欧洲黑杨49个基因共15002个密码子、颤杨的55个基因24984个密码子、毛果杨的173个基因115716个密码子、毛果杨和美洲黑杨所得杂交杨的41个基因14531个密码子、美洲黑杨的20个基因9894个密码子、欧洲山杨与颤杨的杂交杨114个基因48153个密码子、欧洲山杨和银白杨所得杂交杨72个基因共29918个密码子的密码子使用频率进行了统计，结果见表1，从表1中可以看出不同杨属植物最优密码子大部分均相同，如Ile、Val和Ala等。但也有些氨基酸所使用的最优密码子有所不同，如phe和Pro。即使不相同的，如脯氨酸所使用的同义密码子有CCU、CCC、CCA、CCG，均以AT结尾的密码子为最优密码子，CCU和CCA在不同种杨树中的使用频率均大大高于以CG结尾的密码子。虽然只使用了20个美洲黑杨的基因进行分析，但是结合本表，可以判断出美洲黑杨的密码子使用频率高低依次为：TTT:TTC；TTA:TTG:CTT:CTC:CTA:CTG；GTT:GTC:GTA:GTG；CCT:CCC:CCA:CCG；ACT:ACC:ACA:ACG；GCT:GCC:GCA:GCG；TAT:TAC；TAA:TAG；CAT:CAC；CAA:CAG；AAT:AAC；AAA:AAG；GAT:GAC；GAA:GAG；TGT:TGC；CGT:CGC:CGA:CGG:AGA:AGG；GGT:GGC:GGA:GGG；AGT:AGC:TCT:TCC:TCA:TCG。表1杨树高频密码子分析表选取Bt杀虫基因crylAh1(64nt-1998nt)基因野生型序列为原始序列利用表1对cry1Ah1基因编码区全长起始密码子开始第64nt-1998nt杀虫关键区域共645个氨基酸，在不改变原有氨基酸一级序列的前提下进行密码子优化，得到两种优化方式，共长2155bp，cry1Ah1-B基因(碱基序列如SEQIDNO.2所示)是未进行最优密码子全部替换全序列，cry1Ah1-U基因(碱基序列如SEQIDNO.3所示)是进行最优密码子全部替换全序列，cry1Ah1-0基因(碱基序列如SEQIDNO.1所示)是原始野生Bt菌中的基因，将优化后的基因与优化前基因的所有基因翻译的蛋白经过tBlastX比较均完全一致，如图1所示。cry1Ah1基因优化前后物理参数的比较，如表2所示。表2cry1Ah1基因优化前后物理参数的比较注：最小自由能为mRNA二级结构最小自由能。实施例21、实施例1人工改造后的cry1Ah1杀虫基因，进行人工合成，然后进行原核表达载体构建的蛋白检测菌体用北京康为世纪生物技术有限公司生产的细菌蛋白提取试剂盒提取细胞质总蛋白和包涵体总蛋白，然后用金标Bt试纸条检测Bt蛋白(如果检测液内含有Bt蛋白，在试纸条的质控带下方会出现一条检测带)，分别对发酵液上清、包涵体提取液和细胞裂解后可溶蛋白液体进行试纸条检测，结果表明PET-Bt、PET-Bt-U,PET-Bt-B菌株表达的蛋白都位于包涵体内(如图2)，原核表达结果说明优化后的基因在E.coli中能正常表达。2、载体构建和南林895杨的遗传转化通过gateway技术，将cry1Ah1-B和cry1Ah1-U基因从入门载体pENTR上转入植物表达载体pGWB402上，得到含有目的基因的植物表达载体pG本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人工合成cry1Ah1基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种人工合成cry1Ah1基因，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述的人工合成cry1Ah1基因在表达Bt蛋白中的应用。3.权利要求1所述的人工合成cry1Ah1基因在转基因杨树中的应用。...

【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛强，续晨，周加宝，董静，魏辉，尹佟明，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32