组蛋白甲基化H3K4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种组蛋白甲基化H3K4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明专利技术以H3K4me3为切入点，采用细胞生物学方法研究其对猪卵巢颗粒细胞功能的影响。本发明专利技术技术方案设计周详，结果可靠。为证实H3K4me3对猪卵巢颗粒细胞功能的影响，本发明专利技术从多层次、多角度验证，在细胞水平以及蛋白水平进行验证。本发明专利技术阐明了H3K4me3对猪卵巢颗粒细胞功能的影响：H3K4me3能够促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡，降低阻滞于GO/G1期的猪卵巢颗粒细胞比例；这些对研究组蛋白甲基化对卵巢卵泡发育及母猪繁殖性能的影响机制具有很好的应用价值。

Application of histone methylation H3K4me3 in porcine ovarian granulosa cells

The invention discloses the application of histone methylation H3K4me3 in porcine ovarian granulosa cells, belonging to the field of cell engineering and genetic engineering technology. The present invention is based on H3K4me3, and studies its effects on the function of porcine ovarian granulosa cells by cell biology method. The technical scheme of the invention has detailed design and reliable results. In order to verify the effect of H3K4me3 on the function of porcine ovarian granulosa cells, the present invention is verified at various levels and angles, and is verified at cellular level and protein level. The present invention illustrates the effect of H3K4me3 on the function of porcine ovarian granulosa cells: H3K4me3 can promote the proliferation of porcine granulosa cells, inhibit the apoptosis of porcine granulosa cells, and reduce the proportion of porcine granulosa cells in GO/G1 phase. These are of good value for studying the mechanism of histone methylation on the development of egg follicle and the reproductive performance of sows.

【技术实现步骤摘要】
组蛋白甲基化H3K4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用
本专利技术属于细胞工程和基因工程
，具体涉及一种组蛋白甲基化H3K4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
技术介绍
生产繁殖效率对猪肉的经济效益有很大影响，约10％～30％的选育后备母猪因乏情或受孕易失败被淘汰，近年来国内外学者在生产繁殖性状的基础研究和实际应用方面开展了许多工作。就雌性动物来说卵巢是母猪正常繁殖的基础，卵泡的生长分化是卵巢机能的重要保证，颗粒细胞的分化和生长是原始卵泡生长启动的关键，猪卵巢颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要标志，当卵泡发生闭锁时，颗粒细胞产生的雌激素减少，孕激素随之增加，从而引起机体一系列生理生化反应。影响母猪生产繁殖效率的因素主要包括：遗传、饲喂量和营养、温度、光照及其他因素，其中表观遗传学是近年来的研究热点。表观遗传学(epigenetics)是指在DNA双链序列未改变的情况下，基因的表达发生改变，即未改变基因型的前提下改变表型。表观遗传的现象有很多，已知的有DNA甲基化(DNAmethylation)、组蛋白修饰(histonemodification)、基因组印记(genomicimprinting)、母体效应(maternaleffects)、基因沉默(genesilencing)、RNA编辑(RNAediting)等。其中组蛋白翻译后修饰发生在核小体八聚体的各个组份上，例如H3组蛋白上4号赖氨酸的3甲基化(Tri-methylationofHistoneH3lysine4，H3K4me3)，一个特定的组蛋白赖氨酸甲基转移酶(HMT)将3个甲基团转移到H3上，在表观遗传研究中H3K4me3是一个具有转录活性的典型染色质标记，Santos-Rosa等研究表明，H3的4号赖氨酸甲基化可以募集核小体重塑酶和组蛋白乙酰化酶，从而正向调节基因的转录。组蛋白甲基化在不同功能元件具有不同的作用功能，在启动子区H3K4me3负责转录激活，Bradley等的研究表明H3K4me3和H3K27me3在胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESCs)基因组中以共价域(bivalentdomains，BDs)形式调控与发育相关的转录因子(transcriptionalstartsite，TFs)，H3K4me3区域直接与TFs基因的转录起始位点(transcriptionalstartsite，TSSs)重合，且BDs在不同的生理进程中会伴随不同基因表达的激活或抑制。此外H3K4me3结合在基因上的宽度与在细胞识别种类相关，H3K4me3分布情况与基因的转录水平相关。而目前组蛋白甲基化或去甲基化修饰对猪卵巢颗粒细胞的影响仍未见报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种组蛋白甲基化H3K4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。选择H3K4me3抑制剂BCl-121(SIGMA，货号SML1817)和H3K4me3激动剂PBIT(SIGMA，货号SML1058)，通过对细胞形态检测及Westernblot实验方法寻找药物处理猪卵巢颗粒细胞的最佳作用浓度。使用合适的浓度药物处理细胞后，采用Westernblot实验方法探究对应浓度药物对H3K4me3蛋白含量的影响；采用EdU和CCK-8实验方法探究H3K4me3对猪卵巢颗粒增殖的影响；采用AnnexinV/PI和Caspase-3/7实验方法探究H3K4me3对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响；采用流式检测实验方法探究H3K4me3对猪卵巢颗粒细胞周期的影响；采用ELISA方法探究H3K4me3对猪卵巢细胞E2分泌量的影响。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种组蛋白甲基化H3K4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用。体外环境下，H3K4me3能够促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡，降低阻滞于GO/G1期的猪卵巢颗粒细胞比例。优选的，抑制H3K4me3的抑制剂BCl-121的使用浓度为125～150μM；更优选的，最适使用浓度为150μM。优选的，促进卵巢颗粒细胞的增殖或抑制卵巢颗粒细胞的凋亡所用的H3K4me3激动剂PBIT的使用浓度为2～4μM；最适使用浓度为2μM。本专利技术还提供一种组蛋白甲基化H3K4me3在促进猪卵巢颗粒细胞中E2生成的应用。优选的，抑制H3K4me3的抑制剂BCl-121的使用浓度为125～150μM；更优选的，最适使用浓度为150μM。优选的，促进猪卵巢颗粒细胞中E2生成所用的H3K4me3激动剂PBIT的使用浓度为2～4μM；最适使用浓度为2μM。本专利技术的验证结果如下：1、选择最适处理猪卵巢颗粒细胞的药物浓度分别使用50μM、75μM及100μM浓度的H3K4me3抑制剂(BCl-121)及H3K4me3激动剂(PBIT)药物处理细胞，在显微镜下观察细胞状态。进一步根据细胞状态使用100μM、125μM及150μM浓度的H3K4me3抑制剂(BCl-121)药物处粒细胞，观察细胞状态，选择细胞状态较好的125μM和150μM使用浓度，药物处理后的细胞，使用WesternBlot方法检测并对细胞中H3K4me3的含量。进一步根据细胞状态使用2μM、4μM6μM、8μM及10μM浓度的H3K4me3激动剂(PBIT)药物处粒细胞，观察细胞状态，选择细胞状态较好的2μM和4μM使用浓度，药物处理后的细胞，使用WesternBlot方法检测并对细胞中H3K4me3的含量。最终确定H3K4me3的抑制剂BCl-121的最适使用浓度为150μM；H3K4me3激动剂PBIT的最适使用浓度为2μM。2、药物对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响设置浓度梯度后，确认H3K4me3抑制剂(BCl-121)的最适使用浓度为150μM，H3K4me3激动剂(PBIT)的最适使用浓度为2μM。为研究H3K4me3抑制剂(BCl-121)及H3K4me3激动剂(PBIT)对猪卵巢颗粒细胞增殖的影响，分别药物处理细胞，利用CCK-8及EdU法来分析细胞增殖情况。CCK-8结果(图1a)证实H3K4me3抑制剂(BCl-121)药物处理细胞可以显著抑制细胞增殖；H3K4me3激动剂(PBIT)可以显著促进细胞增殖。EdU结果(图1b～1d)证实H3K4me3抑制剂(BCl-121)药物处理细胞能够显著抑制细胞增殖；H3K4me3激动剂(PBIT)可以持续且显著促进细胞增殖。3、药物对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响为研究H3K4me3抑制剂(BCl-121)及H3K4me3激动剂(PBIT)对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响，分别药物处理细胞，利用Caspase-3/7及AnnexinV-FITC法来分析细胞凋亡情况。Caspase-3/7结果(图2a)证实H3K4me3抑制剂(BCl-121)药物处理细胞24h内显著促进细胞凋亡；H3K4me3激动剂(PBIT)处理细胞24h内能够显著抑制细胞凋亡。AnnexinV-FITC结果(图2b～2d)证实H3K4me3抑制剂(BCl-121)药物处理细胞24h内显著促进细胞凋亡；H3K4me3激动剂(PBIT)处理细胞24h能够抑制细胞凋亡，而超过24h后药物作用效果逐渐减弱。4、药物对猪卵巢颗粒细胞周期的影响为研究本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组蛋白甲基化H3K4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：体外环境下，H3K4me3能够促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡，降低阻滞于GO/G1期的猪卵巢颗粒细胞比例。

【技术特征摘要】
1.组蛋白甲基化H3K4me3在猪卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：体外环境下，H3K4me3能够促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡，降低阻滞于GO/G1期的猪卵巢颗粒细胞比例。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：抑制H3K4me3的抑制剂BCl-121的使用浓度为125～150μM。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：抑制H3K4me3的抑制剂BCl-121的最适使用浓度为150μM。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：促进猪卵巢颗粒细胞的增殖或抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡所用的H3K4me3激动剂PBIT的使用浓度为2～4μM。5.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于：促进猪卵巢颗粒细胞的增殖或抑制猪卵巢颗粒细...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁晓龙，何颖婷，张豪，张哲，钟玉宜，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44