特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法技术

本发明专利技术涉及特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法，包括首先对细胞的培养和刺激，接着进行多色免疫表型标记，再以多色流式细胞术为检测平台，建立多色标记术，检测CD4

Specific Antigen Stimulating CD4 Lymphocyte Expression of CD69 for Diagnosis of Tuberculosis Infection

The invention relates to a method for diagnosing tuberculosis bacillus infection by stimulating CD4 lymphocyte expression CD69 with specific antigen. The method includes first cell culture and stimulation, then multicolor immunophenotypic marker, and then multicolor flow cytometry as detection platform to establish multicolor marker and detect CD4.

【技术实现步骤摘要】
特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法
本专利技术涉及医学检测领域，特别涉及特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法。
技术介绍
结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的一种与机体细胞免疫密切相关的慢性传染病，严重威胁着人类健康。近年来，随着MTB耐药株的不断增加与播散，以及卡介苗预防下降，特别是化疗药物和免疫抵制剂的广泛使用，结核病在全球呈明显回升趋势，流行情况日益严峻。中国是结核病的重灾区，结核病发病人数占全球的11.36％，位居全球第二。MTB感染人体后，根据个体的免疫情况，可以发生三种结局:第一种结局是个体免疫力旺盛，直接将感染的MTB杀死；第二种是机体免疫力不足以杀死全部MTB，但能抑制MTB的大量增殖，使之达到平衡状态，从而导致潜伏性结核感染(latenttuberculosisinfection，LTBI)；第三种是机体的免疫力过低导致MTB大量增殖，引发临床疾病。据估计，世界上有近1/3的人口感染结核杆菌，其中只有5％～10％左右的人会发病，其余90％～95％的人群处于潜伏感染。然而，在机体免疫功能紊乱时，可导致LTBI转变为活动性结核病。因此，结核患者尤其是LTBI患者高效及时的结核早期诊断是结核规范性治疗的起点。结核病的实验室诊断技术一直是结核病防控的瓶颈。现有诊断手段包括病原学诊断如MTB分离培养、涂片镜检和分子检测诊断等方法。但上述方法都有各自局限，如MTB分离培养耗时长(一般需要6～8周)，灵敏度不高，且存在生物安全风险，仅在结核病定点医院开展。涂片镜检敏感度低(只有20％～30％的阳性率)，且不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，往往延误治疗。分子诊断操作复杂，且结核杆菌的生物学特性，该方法的灵敏度和特异性不能满足临床需求。以上这些方法都需要从感染部位获取标本如痰、胸水、腹水、脑脊液等，但对于痰涂片阴性或病原学检查阴性，而临床又高度怀疑结核；尤其是无法获取病灶标本如骨结核、肠结核等，对结核病的诊断和排除诊断急需一种新的实验室检查方法，免疫学诊断应运而生。近年来，科学家通过比较基因组学发现了结核分支杆菌具备而卡介苗、其他分支杆菌没有的基因区域，且位于此区域的两个蛋白早期分泌抗原-6(ESAT-6)和培养基滤过蛋白-10(CFP-10)具有较强的Th表位。在此基础之上，结合T细胞免疫检测技术的进展建立了一种新型的结核特异性T细胞免疫体外检测方法——基于酶联免疫斑点技术的结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB)和基于酶联免疫吸附技术的T淋巴细胞γ-IFN体外释放试验(IGRA)。T-SPOT.TB和IGRA的原理基本一致，均为机体对MTB感染后发生的细胞免疫反应。利用特异性的结核抗原ESAT-6和CFP-10作为刺激原，经过全血中的抗原递呈细胞刺激特异性Th细胞产生IFN-γ，于37℃体外培养16-24小时后检测产生IFN-γ的淋巴细胞数量(T-SPOT.TB)或培养液中IFN-γ含量(IGRA.TB)，判断全血中是否存在结核特异性T细胞及其活力。由于采用结核菌特有抗原作为刺激原，不受卡介苗和非结核分枝杆菌的影响，对结核感染的检测灵敏度和特异性均较高。T-SPOT.TB和IGRA两种方法在诊治结核病中的价值无显著区别，但在技术层面，T-SPOT.TB和IGRA.TB共同的缺陷：①是以总淋巴细胞为研究对象，并非CD4+的T淋巴细胞，而CD4+T淋巴细胞是人类抗MTB的主要免疫调节细胞，其检测结果的特异性和灵敏度会受到影响。②是T-SPOT.TB检测细胞内细胞因子的变化，IGRA.TB试验检测的是细胞内释放出来的细胞因子，检测过程较复杂，且影响因素多。③是对T-SPOT.TB而言，检测过程中对分离的PBMC计数要求准确，否则影响结果准确性；结果判断时，用肉眼存在主观性，否则需用仪器读数，且斑点多时有重叠现象；而对IGRA.TB试验来说，虽不用准确计数PBMC数，但用ELISA检测培养上层液的IFN-γ，每次检测均需做标准曲线，不适用单个标本检验，且计算较复杂。
技术实现思路
为了克服现有技术中所存在的上述不足，本专利技术提供了特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法；本专利技术的方法有着操作简单的特点，且用血量与用培养基量小，使得本专利技术的方法还有着经济效益高和适用性广的优点，还增加了诊断的灵敏度和缩短了检测时间，适合在结核病的检测中应用和推广。本专利技术解决其技术问题的技术方案是：特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法，包括以下步骤：1)细胞培养：设三管；第一管为阴性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入CD28和CD49d，使培养基中CD28和CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；第二管为阳性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入PHA、CD28和CD49d，使培养基中PHA浓度为9～11ug/mL和CD28、CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；第三管为测定管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入ESAT-6、CFP-10、CD28、CD49d，使培养基中ESAT-6和CFP-10浓度各为4.5～5.5ug/mL，CD28和CD49d浓度各为0.9～1ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；把阴性对照管、阳性对照管和测定管放入36～38℃、4～6％CO2培养箱中培养20～24小时；2)多色免疫表型标记与流式细胞术检测：从培养的3管全血中各取45～55uL分别加入到三根流式管中，然后，每根流式管中加入CD4-FITC、CD69-APC各4～6uL，常温避光15～20min；加NH4Cl溶血素400～450ul，轻微振荡混匀；调整流式细胞仪中前向与侧向散射光的电压，根据CD4-SS设门，取CD4+细胞分析CD4+CD69+群细胞百分率，测定结果为测定管的CD4+CD69+群细胞百分率－阴性对照管的CD4+CD69+群细胞百分率。作为优化方案，本专利技术的特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法，包括以下步骤：1)细胞培养：设三管；第一管为阴性对照管：在含10％小牛血清的1640细胞培养基中加入CD28和CD49d，使培养基中CD28和CD49d浓度各为1ug/mL后，再加入0.2mL肝素抗凝的外周血；第二管为阳性对照管：在含10％小牛血清的1640细胞培养基中加入PHA、CD28和CD49d，使培养基中PHA浓度为10ug/mL和CD28、CD49d浓度各为1ug/mL后，再加入0.2mL肝素抗凝的外周血；第三管为测定管：在含10％小牛血清的1640细胞培养基中加入ESAT-6、CFP-10、CD28、CD49d，使培养基中ESAT-6和CFP-10浓度各为5ug/mL，CD28和CD49d浓度各为1ug/mL后，再加入0.2mL肝素抗凝的外周血；把阴性对照管、阳性对照管和测定管放入37℃、5％CO2培养箱本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞培养：设三管；第一管为阴性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入CD28和CD49d，使培养基中CD28和CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；第二管为阳性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入PHA、CD28和CD49d，使培养基中PHA浓度为9～11ug/mL和CD28、CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；第三管为测定管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入ESAT‑6、CFP‑10、CD28、CD49d，使培养基中ESAT‑6和CFP‑10浓度各为4.5～5.5ug/mL，CD28和CD49d浓度各为0.9～1ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；把阴性对照管、阳性对照管和测定管放入36～38℃、4～6％CO2培养箱中培养20～24小时；2)多色免疫表型标记与流式细胞术检测：从培养的3管全血中各取45～55uL分别加入到三根流式管中，然后，每根流式管中加入CD4‑FITC、CD69‑APC各4～6uL，常温避光15～20min；加NH4Cl溶血素400～450ul，轻微振荡混匀；调整流式细胞仪中前向与侧向散射光的电压，根据CD4‑SS设门，取CD4...

【技术特征摘要】
1.特异性抗原刺激CD4淋巴细胞表达CD69用于诊断结核杆菌感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)细胞培养：设三管；第一管为阴性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入CD28和CD49d，使培养基中CD28和CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；第二管为阳性对照管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入PHA、CD28和CD49d，使培养基中PHA浓度为9～11ug/mL和CD28、CD49d浓度各为0.9～0.12ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；第三管为测定管：在含9～11％小牛血清的1640细胞培养基中加入ESAT-6、CFP-10、CD28、CD49d，使培养基中ESAT-6和CFP-10浓度各为4.5～5.5ug/mL，CD28和CD49d浓度各为0.9～1ug/mL后，再加入0.2～0.3mL肝素抗凝的外周血；把阴性对照管、阳性对照管和测定管放入36～38℃、4～6％CO2培养箱中培养20～24小时；2)多色免疫表型标记与流式细胞术检测：从培养的3管全血中各取45～55uL分别加入到三根流式管中，然后，每根流式管中加入CD4-FITC、CD69-APC各4～6uL，常温避光15～20min；加NH4Cl溶血素400～450ul，轻微振荡混匀；调整流式细胞仪中前向与侧向散射光的电压，根据CD4-SS设门，取CD4+细胞分析CD4+CD69+群细胞百分率，测定结果为测定管的CD4+CD69+群细胞百分率－阴性对照管的CD4+CD69+群细胞百分率。2.特异性抗原刺激CD4淋巴细...

【专利技术属性】
技术研发人员：周永列，赵慈余，张富杰，夏骏，胡庆丰，
申请(专利权)人：浙江省人民医院，
类型：发明
国别省市：浙江,33