一种基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法技术

本发明专利技术涉及一种美白效果评价方法，具体涉及一种基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法。本发明专利技术将待测样品加入孵化液中，待测样品将渗透入幼鱼的皮肤，然后取出幼鱼，研磨获得组织匀浆，离心，收集沉淀，使用适量纯水重悬，利用渗透压破碎细胞，释放出细胞内黑色素，得到检测液；使用酶标仪或分光光度计进行检测，与未使用化合物的空白对照进行对比，评价待测样品美白效果。本发明专利技术采用上述方法对阳性药物α‑熊果苷等化合物进行评价，结果显示可以定量分析α‑熊果苷的体内美白效果，具有明显剂量依赖性。该方法可在整体动物水平中，定量评价美白效果，实验周期短，成本低廉，可同时进行体内毒性评价，适用于化妆品美白原料的大规模筛选和开发。

An Evaluation Method of Whitening Effect Based on Small Fish Embryos

The invention relates to a whitening effect evaluation method, in particular to a whitening effect evaluation method based on small fish embryos. The method adds the tested sample into the incubation solution, and the tested sample will penetrate into the skin of the juvenile fish, then take out the juvenile fish, grind to obtain tissue homogenate, centrifuge, collect and precipitate, use appropriate amount of pure water to suspend, use osmotic pressure to break up cells, release intracellular melanin, and obtain the detection solution; use enzyme scaler or spectrophotometer to detect, and compare with the blank of unused compounds. The whitening effect of the tested samples was evaluated by comparison. The method adopts the above method to evaluate the positive drug, such as alpha arbutin, and the result shows that the whitening effect of alpha arbutin in vivo can be quantitatively analyzed, with obvious dose dependence. This method can quantitatively evaluate the whitening effect at the overall animal level, with short experimental period and low cost. It can also evaluate the toxicity in vivo. It is suitable for large-scale screening and development of cosmetic whitening raw materials.

【技术实现步骤摘要】
一种基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法
本专利技术涉及一种美白效果评价方法，具体涉及一种基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法。
技术介绍
美白效果是现代化妆品的重要功效之一。通常认为其生物学靶点之一在于抑制络氨酸酶的活性，或抗多巴醌的氧化，从而抑制黑色素的合成。随着需求量的增长，美白化妆品的产品研发投入日益增加，可靠、高效、便捷的美白原料筛选技术具有不可替代的应用价值。美白效果主要针对皮肤，而皮肤则是人体的重要器官，其改变与整个机体密切相关。目前，美白功效的筛选评价方法尚未有统一标准，现有技术主要基于局部的观察和体外间接的细胞或生化实验，其主要包括：1)体外检测化合物对酪氨酸酶的抑制；2)体外检测化合物对抗氧化物质的影响；3)体外使用黑色素瘤细胞检测色素产生等。黑色素是影响美白的重要因素，减少的黑色素的产生可以形成美白的功效。因此，对皮肤黑色素的生成进行定量的评价可以反应产品美白的功效。但是，皮肤作为机体的一个重要功能器官，皮肤黑色素的生成不仅与黑色素细胞直接相关，还与黑色素细胞所在组织中的微环境、其它相关细胞及体液神经因素调解相关。其合成、转运及代谢等过程，有多种细胞、组织参与。因此，皮肤黑色素可能涉及皮肤表皮层、真皮层和皮下组织的生理环境及代谢改变，甚至受整个机体功能代谢的影响。所以，对黑色素和酪氨酸酶等个别因素的评价，并不能直接代表皮肤颜色改变的综合结果，现有技术采用单纯的体外实验和单一的细胞评价标准无法可靠的模拟整个皮肤在生物体内的实际情况。因此，需要有对皮肤做整体评价的指标。同时，对美白产品或效果的评价，不仅要考查美白的功效，更要考虑产品安全性，考察和评价长期使用美白产品的同时，对皮肤局部、周边组织以及全身的可能毒副作用。现有的基于局部观察和体外细胞或生化的评价方法显然不能满足上述评价的需要，不能完全满足美白产品开发的市场和安全需求，不能满足消费者日益增长的对美白产品的功效及安全性认识的需求。因此，开发用于评价美白产品的整体的动物模型，对于研制有效安全的美白产品具有重要意义。以斑马鱼为代表的多种小型鱼类，作为整体的模式动物，已被广泛用于药效功能评价、药理机制研究等众多领域，其与大小鼠、猴子等哺乳类模式动物相比，具有研究周期短、成本低、实验简单方便等优势，尤其是可在整体动物水平上，进行高效直观的筛选评价，这些特点对于皮肤功能及美白效果的评价具有特别的优势。然而，迄今为止，斑马鱼尚未被用于化合物美白效果的评价体系。虽然，现有文献已有报道，通过显微镜观察斑马鱼体表黑色素的变化，来评价化合物的美白效果，但该方法并不能对美白效果进行定量分析，也没有对化合物可能产生的其他毒性进行评价。所以，该方法并不能作为美白效果评价的标准体系，也不适合工业化推广。因此，开发新型的，简便、可靠、准确定量的，适合工业化推广和应用的美白效果评价方法，依然具有重要的实际应用价值。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足和缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法，该方法简单易行，成本低，不依赖复杂仪器设备，适用于高效的原料功效筛选及活性评价。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法，包含如下步骤：(1)挑选斑马鱼健康受精卵，将其置于Holtfreter’sSolution中，25～32℃恒温培养至24hpf，培养密度不超过10胚胎/cm2，避免密度过高引起的死亡；(2)将步骤(1)中发育至24hpf的健康胚胎转移至含有Holtfreter’sSolution的24孔板中，每孔20～30枚胚胎；然后在24孔板各孔中，加入不同浓度待测样品，25～32℃恒温培养至48hpf；(3)将步骤(2)中培养至48hpf的胚胎进行破碎匀浆，得到匀浆液；离心，弃去上清，收集沉淀；(4)将步骤(3)制得的沉淀用纯水重悬，得到检测液，然后在400～450nm波长处检测吸光度，进行相对定量，或者利用标准品进行绝对定量；步骤(1)中所述的恒温培养的温度优选为28℃；步骤(2)中所述的24孔板中Holtfreter’sSolution的用量优选为400～600μL；步骤(2)中所述的24孔板中Holtfreter’sSolution的用量进一步优选为500μL；步骤(2)中所述的恒温培养的温度优选为28℃；步骤(3)中所述的培养至48hpf时，可同时对胚胎的皮肤表面进行美白效果观察和异常现象观察，对胚胎的行为学进行观察与评价，以评价可能的毒性影响(例如：整体毒性、心脏毒性等)；所述的美白效果观察的具体操作优选为：胚胎用甲基纤维素固定液(甲基纤维素的含量3％～5％(W/V))固定于载玻片上，至于显微镜下，观察胚胎体表黑色素情况并拍照；步骤(3)中所述的破碎匀浆的条件优选为在组织匀浆机中30～50Hz处理25～35s；步骤(3)中所述的破碎匀浆的条件进一步优选为在组织匀浆机中45Hz处理30s；步骤(3)中所述的离心的条件优选为3000～5000rpm离心10～20min；步骤(4)中所述的纯水用量为10μL纯水/胚胎(此处胚胎是指步骤(3破碎)匀浆前的胚胎)；步骤(4)中所述的检测优选采用酶标仪或分光光度计进行检测；步骤(4)中所述的检测进一步优选为：将检测液加入96孔板中，使用酶标仪或分光光度计，在400～450nm波长处检测吸光度，药物浓度对吸光度做图，进而指征化合物抗黑色素能力，用以评价其美白效果；步骤(4)中所述的绝对定量优选采用外标法或者内标法；步骤(4)中所述的检测液也可进行毒性检测，例如：检测炎症与凋亡因子；本专利技术的原理：斑马鱼易于人工养殖，成本低廉，容易获得受精卵。在它们发育初期，多为通体透明，而发育至1～2天后，开始自然产生黑色素。在此阶段将胚胎裂解，可得到反映黑色素含量的混悬液。通过酶标仪或分光光度计等设备，对样品进行检测，其吸光度值即可定量反应样品中黑色素浓度。(1)将待测样品(例如：待测化合物)加入孵化液(含小型鱼类生长中的胚胎)，待测样品将渗透入胚胎的皮肤，可对胚胎的皮肤表面进行美白效果和异常现象进行观察，对胚胎的行为学进行观察与评价，以评价可能的毒性影响；(2)取出胚胎，研磨获得组织匀浆，离心，收集沉淀，使用适量纯水重悬，利用渗透压破碎细胞，释放出细胞内黑色素，得到检测液；使用酶标仪或分光光度计进行检测，与未使用化合物的空白对照进行对比，评价待测样品美白效果；其中，如需绝对定量，则建立黑色素标准曲线，待测样品吸光度与黑色素标准曲线进行对比，得到定量结果。同时，可对检测液进行染色、计数，评价化合物对细胞活力的影响，对炎症因子、凋亡因子进行检测，评价化合物对免疫及细胞凋亡的影响。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术提供了一种基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法，该方法基于小型鱼类，在整体动物水平中，可定量评价化合物体内美白效果。(2)本专利技术作为定量方法，可结合显微镜同时观察美白的效果，且可同时对其毒副作用进行评价。(3)本专利技术简单易行，成本低廉，不依赖复杂仪器设备，实验周期短，适用于高效的原料功效筛选及活性评价，可靠，准确，可定量，适合于工业化推广和使用。附图说明图1是使用1-苯基-2-硫脲(Phenylthiourea，PTU)确定检测波长结果分析图。图2是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法，其特征在于包含如下步骤：(1)挑选斑马鱼健康受精卵，将其置于Holtfreter’s Solution中，25～32℃恒温培养至24hpf，培养密度不超过10胚胎/cm

【技术特征摘要】
1.一种基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法，其特征在于包含如下步骤：(1)挑选斑马鱼健康受精卵，将其置于Holtfreter’sSolution中，25～32℃恒温培养至24hpf，培养密度不超过10胚胎/cm2，避免密度过高引起的死亡；(2)将步骤(1)中发育至24hpf的健康胚胎转移至含有Holtfreter’sSolution的24孔板中，每孔20～30枚胚胎；然后在24孔板各孔中，加入不同浓度待测样品，25～32℃恒温培养至48hpf；(3)将步骤(2)中培养至48hpf的胚胎进行破碎匀浆，得到匀浆液；离心，弃去上清，收集沉淀；(4)将步骤(3)制得的沉淀用纯水重悬，得到检测液，然后在400～450nm波长处检测吸光度，进行相对定量，或者利用标准品进行绝对定量。2.根据权利要求1所述的基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法，其特征在于：步骤(2)中所述的24孔板中Holtfreter’sSolution的用量为400～600μL。3.根据权利要求1所述的基于小型鱼类胚胎的美白效果评价方法，其特征在于：步骤(3)中所述的培养至48hpf时，可同时对胚胎的皮肤表面进行美白效果观察和异常现象观察，对胚胎的行为学进行观察与评价，以评价可能的毒性影响。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵海山，宋来思，谭文，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44