蛋白质组合物和分析微生物群的方法技术

一种同位素标记微生物群样本的方法。它涉及提供从给定的来源获得的第一微生物群样本；将第一个微生物群样本暴露于富含同位素的培养基中；并培养在富含同位素的培养基中的所述暴露的第一微生物群样本，以获得同位素标记的微生物群样本，其中，所述同位素标记的微生物群样本的所述同位素标记的元蛋白质组是最初从所给定的来源获得的第一微生物群样本所携带的分类群的特异分类群。

Protein compositions and methods for microbial analysis

A method for isotope labeling of microbial samples. It involves providing first microbial group samples from a given source; exposing the first microbial group samples to isotope-rich media; and culturing the exposed first microbial group samples in isotope-rich media to obtain isotope-labeled microbial group samples, in which the isotope-labeled microbial group samples are isotope-labeled. The recorded proteome is a specific taxon of the taxa carried by the first microbial group sample originally obtained from a given source.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】蛋白质组合物和分析微生物群的方法本申请要求2016年6月1日提交的美国临时专利申请62/344,247的优先权。
本申请一般涉及用于元蛋白质组学的组合物和方法，更具体地涉及用于微生物群蛋白质组份分析的组合物和方法。
技术介绍
人体拥有数万亿个微生物，它们共同构成人类微生物群。越来越多的证据表明微生物群组成与许多疾病相关，包括炎症性肠病(IBD)，肥胖，糖尿病，癌症，心脏病，尿石症，过敏等[2]。微生物群是一个高度复杂且极其敏感的系统，已经证明微生物群组合物由于接触各种化合物而易于改变，包括但不限于治疗剂，赋形剂，添加剂，防腐剂，化学品，压力，运动，食品和饮料，这些化合物可影响健康的维持以及疾病的发展。除了整个微生物群外，还描述了器官和区域特异性微生物群，其中这些微生物的子集形成群体，例如肠，皮肤，阴道，口腔，肾，膀胱，眼睛，肺和乳房。此外，已经表明，许多这些环境，化学和营养化合物引起的变化有可能引起这些区域的积极变化，以改善微生物群的组成和多样性，而其他患病或不健康的微生物群而引起的负面变化有关。例如，已经证明乳化剂，加工食品的普遍成分，导致肠道微生物群组成的负面变化，引起炎症和疾病，同时显示益生元增加有益微生物的水平，增加肠道微生物的健康。但是这些成分的改变将如何影响整体功能，这仍是一个悬而未决的重要问题。最大的微生物群之一存在于胃肠道并构成肠道微生物群[1]。利用粪便微生物群移植(FMT)治疗复发性艰难梭菌感染[3]，说明肠道微生物群对人类健康的重要性。此外，已经显示，微生物群继续在整个疾病的过程中经历变化，这是最近在IBD中显示出来的，其中，肠道微生物群合物的变化与克罗恩病的疾病严重程度紧紧地相关。显然，微生物群似乎参与多种疾病的发展，进展和消退，并且在某些情况下，可以对其调节以影响疾病结果，使得微生物群在科学和公共卫生社区中引起全球关注。除人类微生物群外，还可以识别和描述许多其他微生物群落或微生物群。其中最突出的是土壤微生物群，这是一个复杂的微生物群落，可能因地区，气候和耕种而异。可以评估土壤微生物群的组成以确定生物多样性，并且这些微生物在营养物的产生和分解中的后续功能对农业具有广泛的影响。生物膜是另一个经过充分研究的微生物群，其可能在许多环境和工业环境中具有不同的复杂性，并且可能导致污染或毒性。了解生物膜内微生物的组成和功能对于了解生物膜的预防和分解非常重要。最后，农业和实验场景中的动物微生物群分别对于食品生产和研究的进步非常重要。农业动物的微生物群可以通过抗生素和饲料来影响，这些变化具有影响到繁殖，动物健康和随后的食物生产的潜力。此外，最近已经认识到，实验室研究动物的微生物可能对他们的治疗反应产生深远的影响。更深入地了解这些动物的微生物群成和功能可能会改善对药物代谢的理解和治疗反应的微生物群效应。下一代测序(NGS)，如元基因组学和元转录组学，是非常适合于检查微生物群的组成和预测其潜在的功能，但是，它并没有提供关于基因是否被转化成蛋白质的直接证据。因此这些信息，不提供微生物群的功能变化的数据，需要这样的数据来了解组成的改变如何影响功能，及其是否在生理上产生有意义的方式的影响。相反，元蛋白质组学可以通过直接分析蛋白质表达水平，提供关于微生物的功能活动的宝贵信息，其指示功能[4，5]。与元基因组学形成鲜明对比的元蛋白质组学方法只被应用到对微生物的有限研究。这至少部分是由于与微生物肽/蛋白质的识别和定量相关的困难。最近通过使用大型微生物蛋白质数据库[6]的迭代搜索显著改善了肽/蛋白质识别算法。相反，仍然缺乏用于肽/蛋白质定量的准确方法。大多数当前的元蛋白质组学方法是基于无标记量化(LFQ)，其在单独的样本处理和质谱运行时存在显著变化的缺点，使得数据极难在实验或数据集之间进行比较。通过细胞培养中的氨基酸(SILAC)和哺乳动物的稳定同位素标记(SILAM)进行的稳定同位素标记是目前最广泛使用的定量蛋白质组学方法，并提供较低的可变性[7]。在SILAC/SILAM中，一个测试或参考样本中的蛋白质用同位素重氨基酸代谢标记，使得能够在不同样本之间进行定量比较。然而，这种方法在细菌中的应用，尤其是复杂的细菌种群，如微生物，是受到限制的。一个应用这些代谢标记到微生物群的挑战是固有的高的物种多样性，这于哺乳动物细胞中是不存在的。此外，不同的微生物群通常包括需氧物种和许多厌氧物种，这些物种极难培养以获得足够的标记。这些复杂的种群也几乎不可避免地导致生物合成氨基酸的多样化代谢能力，这阻碍了重标记氨基酸完全掺合微生物蛋白质中。相反，氮或碳的完全代谢标记仅适用于单个细菌[8]，和环境微生物群落，如酸性矿山排水生物膜[9]。然而，缺乏用于表征微生物群蛋白质组的应用。因此，需要更好的元蛋白质组学方法来分析微生物。
技术实现思路
第一个广泛的应用方面是一种快速且经济的整个人体微生物群代谢标记策略，被称为稳定同位素标记的微生物群(SILAMi)。应当理解，整个人体微生物群，意味着SILAMi可用于提供取自人微生物群的任何微生物群样本的代谢标记。人微生物群样本，它是指这样的样本，但不限定于，肠道菌群样本，阴道微生物群样本，口腔微生物群样本，表皮微生物群样本，阴道微生物群样本，膀胱微生物群样本，肾微生物群样本，肺微生物群样本，眼部微生物群样本，乳腺微生物群样本，阴茎微生物群样本，微生物群粘膜样本等。技术人员也将容易理解SILAMi也可以应用于源自动物样本的微生物群，其中该动物例如是哺乳动物，鸟类，爬行动物等。申请人已经发现，对于具有大的微生物群的给定微生物群样本，可以使用同位素标记标准品。在申请人的发现之前，人们认为不能同时标记多样的微生物群，并且在掺合标记期间微生物群将迅速变化，从而不能获得代表所采样的原始微生物群的可靠标准品。然而，申请人已经发现，在同位素掺合过程之后实现的同位素标记的标准品实际上代表了原始样本的微生物群的主要群体和及其蛋白质的代表。微生物群的这种同位素标记称为SILAMi。因此，SILAMi是实现成功标记大型微生物群(微生物群)的方法，例如在人或动物目标对象中发现的微生物群。获得这样一个标准品的困难在于例如在所需的微生物群样本中发现的一些微生物物种的脆弱性和低丰度，例如对环境变化或暴露于氧气敏感(例如，这些微生物中的一些在厌氧条件下生长)。此外，并非所有这些微生物都具有相同的细胞周期或生命周期，一些微生物需要更长的时间来生长和掺合同位素。然而，在培养中生长和掺合同位素所花费的时间越长，在微生物群样本中发现的某些物种将死亡或不成比例地增殖的风险就越大，将不能忠实地描述样本中发现的微生物群。SILAMi已经克服了这些先前的问题并成功地为来自微生物群样本的给定微生物提供了同位素标记的标准品，其中样本可以取自，例如，人类，动物，土壤，植物，水或任何其他具有大量微生物的来源。此外，申请人已经发现使用同位素标记的标准品，例如使用SILAMi实现的标准品，允许研究给定微生物群样本中的大量微生物。该标准品允许确定功能和组成，包括确定微生物群样本的功能和组成的变化。此外，标准品提供了在进行微生物群样本的元蛋白质组分析时减少变异性的方法。例如，这可以通过向微生物群样本中添加已知量的标准品物(具有已知比率并测量样本的重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种标记微生物群样本的方法，包括：提供从给定来源获得的微生物群样本；将所述微生物群样本暴露于富集培养基中；和培养所述微生物群样本以获得具有标记的蛋白质组的微生物群样本。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.01 US 62/344,2471.一种标记微生物群样本的方法，包括：提供从给定来源获得的微生物群样本；将所述微生物群样本暴露于富集培养基中；和培养所述微生物群样本以获得具有标记的蛋白质组的微生物群样本。2.通过实施权利要求1中定义的方法获得的标记蛋白质的微生物群标准品，其中所述标记蛋白质的微生物群标准品包含代表来自所选微生物群的蛋白质组的标记蛋白质。3.如权利要求1所述的方法，其中所述标记的微生物群样本对于最初从所述给定来源获得时的所述第一微生物群样本中存在的分类群具有分类特异性。4.如权利要求3所述的方法，还包括通过对所述标记的微生物群样本进行元蛋白质组分析，来表征所述标记的微生物群样本。5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述标记的微生物群样本对于最初从所述给定来源获得时的所述第一微生物群样本中存在的预定比例的分类群具有分类特异性。6.如权利要求3至5中任一项所述的方法，其中所述暴露的第一微生物群样本的所述培养持续一段时间，以获得所述标记的蛋白质代表的至少70％的元蛋白质组的富集平均水平，并对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中存在的预定比例的微生物群具有分类特异性。7.如权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述暴露的第一微生物群样本的所述培养持续一段时间，以获得所述标记的蛋白质代表的至少90％的元蛋白质组的富集平均水平，并对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中存在的预定比例的微生物群具有分类特异性。8.如权利要求3至7中任一项所述的方法，其中所述暴露的第一微生物群样本的所述培养持续一段时间，以获得所述标记的蛋白质代表的至少95％的元蛋白质组的富集平均水平，并对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中存在的预定比例的微生物群具有分类特异性。9.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述暴露的第一微生物群样本的所述培养持续一段时间，以获得代表暴露的第一微生物群样本的元蛋白质组的标记蛋白质的预定平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中的至少50％的微生物群具有分类特异性。10.如权利要求9所述的方法，其中所述暴露的第一微生物群样本的所述培养持续一段时间，以获得代表暴露的第一微生物群样本的元蛋白质组的标记蛋白质的预定平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中的至少90％的微生物群具有分类特异性。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述暴露的第一微生物群样本的所述培养持续一段时间，以获得代表暴露的第一微生物群样本的元蛋白质组的标记蛋白质的预定平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中的至少90％的微生物分类门具有分类特异性。12.根据权利要求9-11中任一项所述的方法，其中所述暴露的第一微生物群样本的所述培养持续一段时间，以获得代表暴露的第一微生物群样本的元蛋白质组的标记蛋白质的预定平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中的至少90％的微生物分类属具有分类特异性。13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述暴露的第一微生物群样本的所述培养持续一段时间，以获得代表暴露的第一微生物群样本的元蛋白质组的标记蛋白质的预定平均富集水平，并且对于最初从给定来源获得的第一微生物群样本中的至少90％的微生物物种具有分类特异性。14.如权利要求3-13中任一项所述的方法，其中所述富集培养基是富含同位素的培养基，并且其中所述蛋白质组的微生物群样本是同位素标记的。15.如权利要求14所述的方法，其中所述暴露所述第一微生物群样本的同位素富集培养基含有选自13C，14C，15N，32S，35S，32P和氘的同位素，及其组合。16.如权利要求3-15中任一项所述的方法，其中，从人类目标对象得到所述第一微生物群样本。17.如权利要求3-16中任一项所述的方法，，其中，从动物目标对象得到所述第一微生物群样本。18.如权利要求3-17中任一项所述的方法，其中提供的所述第一微生物群样本是以下类型的微生物群样本中的一种：肠道微生物群样本；真皮微生物群样本；阴道微生物群样本；口腔微生物群样本；肺微生物群样本；粘膜微生物群样本；膀胱微生物群样本；肾脏微生物群样本；眼睛微生物群样本；阴茎微生物群样本；和乳房微生物群样本。19.一种对第二微生物群样本进行组份分析的方法，包括：使用通过执行如权利要求3-18中任一项所述的方法获得的标记微生物群样本作为标记标准品，以进行第二微生物群样本的组份分析，其中所述组份分析由于所述标记标准品的使用而得到增强。20.如权利要求19所述的方法，其中进行所述组份分析的第二微生物群样本具有与所述第一微生物群样本相同的微生物群样本类型。21.如权利要求19或20所述的方法，还包括，在使用标记标准品进行第二微生物群样本的组份分析之前，提供从与用于获得标记标准品的微生物群样本相同的来源获得的第二微生物群样本。22.如权利要求19至21中任一项所述的方法，其中使用标记的微生物群样本作为标记标准品来执行第二微生物群样本的组份分析，包括进行元蛋白质组分析，并且元蛋白质组分析用于测量所述第二微生物群样本的一种或多种蛋白的量，所述元蛋白质组分析包括：从所述第二微生物群样本中获得蛋白质提取物；掺合所述蛋白质提取物和所述标记标准品；和获得标记标准品中的标记/未标记的蛋白质比，和第二微生物群样本中的一种或多种蛋白质的标记/未标记的蛋白质比。23.如权利要求22中所述的方法，其中所述元蛋白质组分析进一步包括获得所述第二微生物群样本的无标记定量(LFQ)。24.如权利要求19-23中任一项所述的方法，其中，使用标记的微生物群样本作为标记标准品来执行组份分析的第二微生物群样本可以包括进行元基因组分析。25.如权利要求24中所述的方法，其中，所述元基因组分析包括基于16S的测序。26.如权利要求24中所述的方法，其中，所述元基因组分析包括鸟枪法测序。27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中，执行所述组份分析以实现以下的至少一个：目标对象的疾病诊断；评估目标对象的治疗反应；评估接受治疗的目标对象的缓解情况；筛选目标对象微生物群的异生物质效应；筛选化合物对目标对象微生物群的影响，其中所述化合物是食物，药物，化学物质，治疗剂，毒素，毒物，饮料，食品添加剂，化妆品，化妆品成分，包装材料，杀虫剂，除草剂，消费品中的一种；和筛选微生物群以识别目标对象对理疗或治疗的反应性。28.如权利要求27所述的方法，其中执行所述的组份分析，以实现筛选异生物质对目标对象微生物的影响，第二微生物群样本从目标对象获得，在所述目标对象接触一种或多种异生物质之后执行组份分析。29.如权利要求27所述的方法，其中执行所述的组份分析，以实现筛选化合物对目标对象微生物的影响，第二微生物群样本从目标对象获得，在所述目标对象接触一种或多种化合物之后执行组份分析。30.根据权利要求28或29所述的方法，其中基于所述组份分析生成概况。31.如权利要求30所述的方法，其中所述概况被整合到诊断或预后的方法中。32.如权利要求27所述的方法，其中执行组份分析以实现对目标对象的疾病诊断，其中使用标记的微...

【专利技术属性】
技术研发人员：约瑟夫·米歇尔·丹尼尔·菲格斯，阿兰·克里斯托夫·施廷青，戴维·R·麦克，张旭，宁志斌，
申请(专利权)人：渥太华大学，
类型：发明
国别省市：加拿大,CA