人儿茶酚－Ｏ－甲基转移酶（ＣＯＭＴ）测定制造技术

本文公开了定量样品中儿茶酚胺－Ｏ－甲基转移酶（ＣＯＭＴ）蛋白的量的测定（测定法），所述样品为例如来自细胞培养物、体液、组织的提取物以及环境样品。其在竞争性ＥＬＩＳＡ系统中将新型试剂（抗－ＮＥ、ＣＯＭＴ－ＮＥ或ＣＯＭＴ－表位－ＮＥ）与先前所述的两种试剂（抗－ＣＯＭＴ和ＣＯＭＴ）联合使用以实现此目的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人儿茶酚-0-甲基转移酶OiOMT)测定
技术介绍
COMT为存在于人体许多组织中的酶。其主要功能为使起激素和神经递质作用的肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺(儿茶酚胺)失活，从而促进从身体移除这些物质。本专利技术人以前已表明该酶的细胞水平由雌激素——雌二醇调节。许多化学物质(人造的和天然存在的)都可模拟或抑制雌二醇的作用。如果进入人体，这样的化学物质可导致对雌二醇正常作用的干扰，并在人生命的各个阶段都引起健康问题。这些化学物质以及影响其它激素作用和新陈代谢的其它化学物质统称为内分泌干扰物。影响雌二醇作用的化学物质很可能是内分泌干扰物中最重要的一类。它们与西方男性的精子数下降以及常见癌症例如乳腺癌和卵巢癌的成因有关。本专利技术人已表明，多氯联苯(PCB ；公认对人类健康和较大范围的环境具有极其严重的威胁)和各种增塑剂及相关化学物质能够调节COMT蛋白表达水平。这些化学物质都不与雌二醇密切相关，但它们都通过与雌二醇相同的机理调节COMT水平(Ho等，2008a, b)。 因而，测定暴露于这样的化学物质的细胞中的COMT蛋白是对该化学物质雌激素活性的一种衡量。从未对存在于或者可能被引入环境中的大量化学物质评估过它们干扰内分泌的雌激素潜能。这是因为作为公认的内分泌干扰试验的二代大鼠试验很耗时间且非常昂贵。欧盟颁布的法规指出存在大约30，000种必须检验的化学物质。如上所述，COMT蛋白测定可能提供干扰雌激素内分泌潜能的衡量。测定COMT蛋白的现有方法慢、工作量大，且受限于样品处理能力。例如，目前人COMT蛋白浓度的测定通过使用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)/蛋白质印迹测定法实现。SDS-PAGE涉及使用包含丙烯酰胺和双丙烯酰胺(它们为神经毒的) 以及十二烷基硫酸钠(它为肺刺激物和致敏物)的缓冲液和凝胶。尽管许多实验室使用商用预制凝胶和制备好的缓冲液，以使工作人员暴露于这些化学物质的程度最小，但是它们存在于实验室环境内，并且需要执行合适的安全规程以确保安全操作和处理。SDS-PAGE/蛋白质印迹法耗时、繁琐、难以准确定量、相对受限于其处理样品的能力，因而也是高成本的。评估COMT浓度的备选方法为测定COMT活性并推断结果。这涉及利用所述酶的放射性底物，以及伴随它们的附带危险和处理污染物的难题。因此，需要一种简单、廉价并可处理很多样品的COMT测定法。下文所述测定法克服了这些难题，因为其易于使用、廉价并具有高样品处理能力。因此，其特别适合作为潜在雌激素内分泌干扰物的初始筛选系统。专利技术简述本专利技术提供用于测定生物培养物、生物组织、生物液体和环境样品中COMT蛋白水平的简单、准确、廉价且快速的方法。本专利技术的其它方面为新型抗体、多肽和多核苷酸。在另外的方面，本专利技术提供包含可用于测定的材料的试剂盒。附图简述附图说明图1描述新型表位(NE)构建体的线性结构。图2阐述COMT测定的实施方案可如何进行。图3显示COMT测定的实施方案如何运作。该测定中的颜色强度与标准样品和未知浓度样品中的COMT浓度成反比。图4提供新型表位(NE)的预测二级结构。图5显示通过抗-NE抗体和抗-COMT抗体检测HEK293细胞中的重组MB-COMT-NE 蛋白。图6显示通过抗-NE抗体和抗-COMT抗体免疫沉淀(IP)和检测HEK293细胞中重组MB-COMT-NE蛋白的结果。图7显示大肠杆菌中的重组MB-COMT-NE蛋白的考马斯蓝蛋白染色。图8显示通过抗-NE抗体、抗-COMT抗体和抗-GST抗体检测重组GST-MB_C0MT_NE 蛋白。图9显示测定抗-NE抗体亲和结合至修饰NE表位的斑点印迹测定结果。还显示了保守(类别内)氨基酸取代的实例的表格，可进行所述取代以产生潜在具有基本相同抗原特性(例如结合抗-NE-表位)的其它NE-表位变体。图10显示在MCF-7细胞裂解物中的COMT竞争性ELISA测定的实例。图11显示COMT EIA试剂盒的标准曲线的实例。序列简述SEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NO 引物。SEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NO专利技术详述COMT为在镁(Mg)存在下催化甲基从辅酶S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)转移至儿茶酚的一个羟基上的遍在酶。其正常生理作用是儿茶酚胺(例如内分泌剂、神经递质剂和升压剂)、多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素的甲基化，而甲基化是这些化合物分解代谢的一部分。以前，本专利技术人确认了人COMT基因的转录由雌二醇以涉及雌二醇α-受体的非经典方式强而有效地调节(Xie等，1999 Jiang等，200 。COMT可能在包括雌激素诱导的癌症、 帕金森病、抑郁症、精神分裂症和高血压(Bonifcicio等，2007 ；Tom等，1998 ；Lewandowski, 2007 ；Houston, 2007)在内的不同人类病症的病理生理学中起重要。这是因为COMT甲基化其它底物，例如儿茶酚雌激素(例如致癌的4-羟基雌二醇)、黑色素新陈代谢中的吲哚中间体、生物异源儿茶酚(例如致癌的类黄酮)以及药物(例如左旋多巴)。另外，COMT的表达不仅受雌二醇的影响，还受化学结构差异很大但具有模拟或拮抗雌二醇作用的能力的化合物的影响。在该类别中的化合物为例如多氯联苯(PCB)和增塑剂例如邻苯二甲酸二异己基酯以及相关化合物例如辛基苯酚(Ho等，2008a，b)。此外，应注:1为18个氨基酸的新型表位(NE)。2为用于含BamHI限制位点的人S-COMT cDNA的正向引物。3为用于含BamHI限制位点的人MB-COMT cDNA的正向引物。4为用于编码NE序列和EcoRI限制位点的S-COMT和MB-COMT的反向5为用于含BamHI限制位点的COMT-表位的正向引物。6为用于COMT-表位并编码NE序列和EcoRI限制位点的反向引物。7为人COMT的残基80-98，其为MB-同工型和S-同工型所共有。8为18个氨基酸的新型表位(NE)的变体#1。9为18个氨基酸的新型表位(NE)的变体#2。:10为18个氨基酸的新型表位(NE)的变体#3。意到的是，人基因的转录调节通常是复杂的，且其它非雌激素物质也可能够通过其它直接和间接途径来充分调节COMT基因的转录。在动物和人的不同生理状态下都发现COMT活性的改变。COMT在肿瘤形成中可能起病因作用(Ho等，2008a, b ；Thompson等，2000)。该测定可用于测量来自各种组织和细胞的提取物以及体液中的人COMT蛋白浓度。因为各种COMT诱导物和抑制剂(例如异源雌激素(xenoestrogen)和现有药物(例如用于治疗帕金森病的恩他卡朋(Entacapone)和托卡朋(Tolcapone)))以及作为不良事件影响COMT表达的药物可影响COMT表达，所以该测定可用于评估这样的化合物的作用。如上所述，作为环境污染物存在的多种化合物例如PCB、增塑剂和异源雌激素影响COMT表达 (Ho等，2008a，b)。因而该测定还可用于评估这样的化合物的作用。此外，环保主义者对工业污染物影响日益增加的担忧已促使欧盟通过立法(生效于2008年(REACH法规))要求制造商评估其工艺中所用化学物本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种分离的多肽，所述多肽包含（１）具有ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ的氨基酸序列的ＮＥ－表位，或者（２）与针对ＮＥ－表位的抗体结合的ＮＥ－表位变体，其中所述ＮＥ－表位变体与ＮＥ－表位的序列具有至少约６０％－８０％、优选约８０％－９０％、更优选约９０％－９５％的序列同一性；或者所述ＮＥ－表位变体通过氨基酸序列中的一个或数个氨基酸的取代、缺失或插入衍生自ＮＥ－表位。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：何树良，
申请(专利权)人：香港大学，
类型：发明
国别省市：HK