本发明专利技术公开了一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物CK-19抗体的多肽序列、多克隆抗体与应用，其氨基酸序列如SEQNO.1所示。本发明专利技术选择了CK-19蛋白一段氨基酸序列进行多肽合成作为免疫原免疫动物制备抗体。涉及：人CK-19蛋白氨基酸特性分析，多肽设计及合成，多肽与载体蛋白KLH偶联及偶联产物纯化，偶联物免疫新西兰兔，抗血清ELISA检测、收集及纯化，纯化抗体ELISA及免疫印迹鉴定。该多克隆抗体可特异性识别及检测人CK-19蛋白，有望为肝癌诊断提供帮助，并指导临床预后判断和治疗方案的选择。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测肝癌标志物CK-19用的兔多克隆抗体，具体地说，涉及一种抗肝脏肿瘤标志物CK-19的多肽抗体的制备及其应用。
技术介绍
细胞角蛋白(Keratin，type I cytoskeletal)是细胞体的中间丝，根据其分子量和等电点不同可分为20种不同类型。在胚胎肝细胞中表达CK8、CK18、CK-19，随着肝脏的分化，CK-19在正常肝细胞不表达，只在胆管中表达。CK-19对胆管上皮和胆管细胞癌(ICC) 具有特异性染色，阳性率达779Γ100%，是目前诊断ICC最好的免疫组化标志物之一。当肝细胞发生癌变时，有些癌细胞又重新表达CK-19，部分为分子结构不完整的CK-19，且表达程度与细胞的分化程度呈负相关。当细胞出现坏死时，CK-19以溶解片段的形式释放于血清中，能在血液中检出，检测指标为细胞角质素偏低抗原。Nagai等报道，在70例肝癌患者中，33例外周血CK-19升高，在同时检测CK-19和AFP的患者中，有12. 3%的患者CK-19升高而AFP正常。两者联合检测对诊断有一定的互补性。Ding SJ等发现CK-19在高转移力细胞株中高表达，且随着转移力的升高表达量亦呈上升趋势。李雁等进一步探索了 CK-19 与肝癌患者临床病理指标的关系，表明血清CK-19升高与HCC分化程度低，血管侵袭力强， 临床病期晚有一定的关系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可特异性识别人肝癌细胞表达的CK-19的多克隆抗体。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物CK-19抗体的多肽序列，其氨基酸序列如SEQ NO. 1所7J\ ο为便于与载体蛋白偶联，在上述多肽序列的C端连接一个半胱氨酸。本专利技术选择了 CK-19蛋白N端14肽作为候选多肽，并用人工方法进行多肽合成制备免疫原。上述多肽序列免疫动物可获得多克隆抗体，所述多克隆抗体能用于制备肝癌诊断药物。本专利技术用上述免疫原免疫新西兰兔，获得可特异性识别人肝癌细胞表达的CK-19 的多克隆抗体。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术对CK-19蛋白氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段肽序列进行人工合成；将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体 mcKLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫新西兰兔；经过多次免疫的兔血清用 ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫兔血清，并用ftOtein G蛋白纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA、western bot等鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别CK-19蛋白，可用于检测肝癌细胞表达的CK-19蛋白，为肝癌诊断提供帮助， 并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。附图说明图1是抗CK-19多克隆抗体经protein G凝胶柱纯化后经SDS-PAGE电泳(12%) 检测结果。M:蛋白Marker =Lane 1 上样峰；Lane 2 流穿峰；Lane 3 平衡峰；Lane 4 洗脱峰。图2是本专利技术中的抗CK-19多克隆抗体的western-blot鉴定结果。上样为H印G2 细胞(人肝癌细胞系)裂解液。具体实施例方式本专利技术设计和人工合成CK-19多肽抗原，与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白 (KLH)偶联，经脱盐纯化后免疫新西兰兔，通过多次免疫及ELISA效价检测后，采集兔血清并经protein G凝胶纯化柱纯化。该多克隆抗体经过ELISA^estern blot等鉴定，可特异性识别人肝癌细胞表达的CK-19蛋白，为肝癌诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本专利技术的权利要求范围之内。实施例1 :CK_19多肽的设计及合成 1. CK-19氨基酸序列根据GenBank获得人CK-19氨基酸序列(P08727)如SEQ N0. 2所示。结果人CK-19蛋白含有400氨基酸。2. http //www. uniprot. org/uniprot 在线分析 CK-19 结构域(表 1) 表权利要求1.一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物CK-19抗体的多肽序列，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ NO. 1所示。2.如权利要求1所述的多肽序列，其特征在于，所述多肽序列在C端连接一个半胱氨酸。3.一种多克隆抗体，其特征在于它由权利要求1所述的多肽序列免疫动物获得。4.权利要求3所述多克隆抗体在制备肝癌诊断药物中的应用。全文摘要本专利技术公开了一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物CK-19抗体的多肽序列、多克隆抗体与应用，其氨基酸序列如SEQNO.1所示。本专利技术选择了CK-19蛋白一段氨基酸序列进行多肽合成作为免疫原免疫动物制备抗体。涉及人CK-19蛋白氨基酸特性分析，多肽设计及合成，多肽与载体蛋白KLH偶联及偶联产物纯化，偶联物免疫新西兰兔，抗血清ELISA检测、收集及纯化，纯化抗体ELISA及免疫印迹鉴定。该多克隆抗体可特异性识别及检测人CK-19蛋白，有望为肝癌诊断提供帮助，并指导临床预后判断和治疗方案的选择。文档编号C07K16/06GK102336814SQ20111020069公开日2012年2月1日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日专利技术者徐伟文, 李明, 陈立勇 申请人:南方医科大学本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物ＣＫ－１９抗体的多肽序列，其特征在于，其氨基酸序列如ＳＥＱ ＮＯ．１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈立勇，徐伟文，李明，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：81
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