本发明专利技术涉及一种含有不多于20个氨基酸的肽段和其应用，目的是为了提供一种能抑制病原真菌和细菌生长的致病杆菌抗菌肽，1.0μg/ml抗菌肽用于抑制病原真菌生长时，对辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、禾谷镰刀菌和灰葡萄孢菌的抑制率分别为60.01％、74.00％、49.21％、60.71％；1.0μg/ml抗菌肽用于抑制细菌生长时，对枯草芽孢杆菌、番茄疮痂病菌、青枯菌、普通变形杆菌和巨大芽孢杆菌分别形成19.04±0.2mm、16.47±0.35mm、10.75±0.41mm、10.3±0.33mm、7.3±0.28mm的抑菌圈。本发明专利技术致病杆菌抗菌肽，其氨基酸序列为GPVGLLSSPGSLPPVGGAP。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种含有不多于20个氨基酸的肽段。
技术介绍
抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽类物质，其分子量通常在几百到一万道尔顿之间，氨基酸个数从几个到几十个不等。因为其具有性质稳定、广谱抗菌、且不易产生耐受菌株等诸多优点而备受青睐。另有报道，抗菌肽是先天免疫反应中进化比较保守的一种产物， 几乎所有生物都存在抗菌肽。申请人从昆虫病原线虫共生菌中挖掘新结构的抗菌肽，不仅可以提供宝贵的抗菌资源，而且为共生菌的开发利用开辟了新的途径。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种能抑制病原真菌和细菌生长的致病杆菌 (Xenorhabdus budapestensis NMC-10)抗菌肽及其应用。一种致病杆菌抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本专利技术还涉及致病杆菌抗菌肽在抑制病原真菌生长中的应用。本专利技术致病杆菌抗菌肽在抑制病原真菌生长中的应用，其中所述病原真菌为辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、禾谷镰刀菌和/或灰葡萄孢菌。本专利技术还涉及致病杆菌抗菌肽在抑制细菌生长中的应用。本专利技术致病杆菌抗菌肽在抑制细菌生长中的应用，其中所述细菌为枯草芽孢杆菌、番茄疮痂病菌、青枯菌、普通变形杆菌和/或巨大芽孢杆菌。本专利技术与现有技术不同之处在于提供一种致病杆菌抗菌肽，1.0 μ g/ml的该抗菌肽用于抑制病原真菌生长时，对辣椒疫霉菌、大丽轮枝菌、禾谷镰刀菌和灰葡萄孢菌的抑制率分别为60. 01%、74. 00%,49. 21%,60. 71% ； 1.0 μ g/ml的该抗菌肽用于抑制细菌生长时，对枯草芽孢杆菌、番茄疮痂病菌、青枯菌、普通变形杆菌和巨大芽孢杆菌分别能形成 19. 04士0. 2mm、16. 47士0. 35mm、10. 75士0. 41mm、10. 3士0. 33mm、7. 3士0. 28mm 的抑菌圈。下面结合附图对本专利技术致病杆菌抗菌肽及其在抑制病原真菌和细菌生长中的应用作进一步说明。附图说明图1是通过不同饱和度的硫酸铵沉淀所获得沉淀物的抑菌活性；图2是NMC-10粗提物进行离子交换层析的层析图，其中“Q穿”表示穿透峰、El表示第一洗脱峰、E2表示第二洗脱峰；图3A是离子交换层析收集的各组分对辣椒疫霉菌的抑制作用；其中“总”表示 NMClO粗提物，“穿”表示穿透峰组分，El表示第一洗脱峰组分、E2表示第二洗脱峰组分；图3B是离子交换层析收集的各组分对枯草芽孢杆菌的抑制作用；其中“总”表示 NMClO粗提物，“穿”表示穿透峰组分，El表示第一洗脱峰组分、E2表示第二洗脱峰组分；图4是离子交换层析收集的各组分进行Tricine-SDS-PAGE的电泳图；其中“稀释总”表示稀释过的NMClO粗提物，"Q穿”表示穿透峰组分，El表示第一洗脱峰组分、E2表示第二洗脱峰组分；图5是穿透峰组分进行反相层析的图谱；图中5-10代表反相层析中收集管的编号；图6是反相层析中收集的各组分对辣椒疫霉菌的抑制作用；图中1-10代表反相层析中收集管的编号；图7是将活性最强的收集管5-8中的组分分别稀释2、8、64倍后测定其对辣椒疫霉菌的抑制作用，图中5A、5B、5C分别表示收集管5中的组分稀释2、8、64倍，图中6A、6B、6C 分别表示收集管6中的组分稀释2、8、64倍，图中7A、7B、7C分别表示收集管7中的组分稀释2、8、64倍，图中8A、8B、8C分别表示收集管8中的组分稀释2、8、64倍；图8是收集管8中的组分再次进行反相层析的图谱，2C2-12，2D9_12都表示收集管的编号 ；图9A是再次进行反相层析时收集的各组分进行Tricine-SDS-PAGE的电泳图， 2C2-3和2C4都表示收集管编号；图9B是再次进行反相层析时收集的各组分对辣椒疫霉菌的抑制作用；图10是2C2-3继续进行反相层析分离纯化时获得的一个组分质谱图。具体实施例方式实施例1致病杆菌培养及发酵代谢液制备采用NBTA培养基(营养琼脂45g，氯化三苯基四氮唑0. 04g,溴百里酚蓝0. 025g 溶于蒸馏水1000ml，调节pH至7. 2)对致病杆菌NMClO菌株进行型态鉴定，挑取蓝色I型单菌落(I型菌是能吸收培养基中的染料，菌落呈现蓝色；II型菌是不能吸收培养基中的染料，菌落成红色)在TSB培养基(胰蛋白胨1.5g，大豆蛋白胨0. 5g，氯化钠0. 5g，用IOOml 蒸馏水配制而成，调节PH为7. 2士0. 2)中进行摇瓶震荡培养，培养条件为28°C、ISOrpm培养48h。5000rpm离心去除菌体细胞，上清液用于抗菌肽分离。实施例2抗菌代谢物的提取(1)硫酸铵沉淀对所得上清液进行硫酸铵沉淀，使硫酸铵分别达到不同的饱和度，4°C过夜， 12000rpm离心收集沉淀。用适当体积20mMTris缓冲液(pH7. 4)对沉淀物进行重悬，再利用透析袋脱盐，先使用蒸馏水、后使用20mMTriS缓冲液进行透析，每隔4h更换一次溶液，透析 48小时。透析袋选取截留分子量在8000D-12000D之间，透析的前期由于浓度差较大需要较频繁地更换缓冲液，并且使用干燥剂聚乙二醇(PEG20000)去除样品中过量的水分使透析能更加充分，循环往复直至透析完成。将透析处理后的提取物用直径为0. 22 μ m的滤膜过滤进，所得到的澄清液体即为NMC-10粗提物。以枯草芽孢杆菌为指示菌、用琼脂扩散抑菌圈试验检测不同饱和度硫酸铵沉淀物的抑菌活性，研究结果证明，硫酸铵饱和度为85%左右时，沉淀的蛋白(指一次性加入硫酸铵使饱和度为85%时，沉淀得到的所有蛋白)抑菌活性较高(见图1)。其中本专利技术中的琼脂扩散抑菌圈法的步骤为在NA斜面(蛋白胨10g、氯化钠5.0g、牛肉浸出粉3g、琼脂12g、自来水1000ml)上培养指示菌，温度为28°C，待出现菌苔后用0. 85%的生理盐水将菌苔洗下并重悬制成菌悬液，在紫外分光光度计下调节菌悬液0D600 = 0.33，然后按照(体积百分数)的比例添加到抗生素鉴定培养基(蛋白胨5g、氯化钠3. 5g、葡萄糖lg、牛肉浸出粉1. 5g、磷酸氢二钾 3. 68g、酵母浸出粉3g、磷酸二氢钾1. 32g、水1000ml)上，在平板上均勻打若干个孔，每孔加入20 μ 1待测样品，28°C培养一天观察抑菌圈大小。对照平板只在孔中加入等量的无菌水。(2)离子交换层析分离用离子交换层析分离NMC-10粗提物，层析柱为MONO Q，每次上样5ml，平衡液为 20mM的Tris-HCl，洗脱液为20mM的Tris-HCl与IM NaCl，流速lml/min。梯度洗脱，有一个组分未挂在离子交换柱上，将该组分称为穿透峰，0%-45%这个梯度出现了第一洗脱峰， 45% -100%出现了第二洗脱峰(45%和100%指的是IM的NaCl在洗脱液中所占的体积百分比)，收集穿透峰和两个洗脱峰，分别记为Q穿和E1、E2 (见图2)，通过琼脂扩散抑菌圈试验分别测定所得各组分对辣椒疫霉菌和枯草芽孢杆菌的抑制活性(分别见图3A和图3B)。分析层析图并比较层析分离效果与抑菌活性的相关程度，各个组分的积分面积与峰高见表1。表1阴离子交换层析参数峰面积(mAU*ml)‘峰面积比(％)峰高(mAU)Number Areas of peakRate of Areas ofHeigh og P本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种致病杆菌抗菌肽，其特征在于：其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀芬，邱德文，曾洪梅，郭立华，刘峥，袁京京，肖尧，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：11
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