家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在抗真菌中的应用及其制备方法技术

本发明专利技术公开了家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在抗真菌中的应用及其分离方法，分离方法如下：将蚕茧分层、剪碎，然后加入pH7.5、100mM的Tris-HCl缓冲液，在37℃、转速220rpm条件下提取30min；然后在室温，转速为10000rpm下离心15min，上清液用0.22μm滤膜过滤后，得家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂；获得的蛋白酶抑制剂能够抑制林伯氏白色念球菌分泌的真菌蛋白酶K的活性，抑制家蚕致病性真菌球孢白僵菌的孢子萌发，并且在沸水中孵育10min后仍保持活性；属于天然的、高活性、高稳定性的抗真菌蛋白质，无毒无害；同时，本发明专利技术利用的蚕丝资源丰富，为蚕丝的多元化开发利用提供了新途径。

【技术实现步骤摘要】
家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在抗真菌中的应用及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在制备抗真菌的药物中的应用，还涉及分离家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的方法和由该方法获得的产品。
技术介绍
我国是世界上蚕丝生产的第一大国，每年的蚕茧产量几十万吨，丝绸工业产值上百亿元，丝绸产品占世界总量的70％以上。然而由于国内丝织业技术和工艺落后的影响，我国的蚕丝产业技术含量低、附加值低。因此，对蚕丝进行深入的研究、深入挖掘蚕丝资源的新用途，对于开拓蚕丝的应用领域、提高蚕丝的应用价值具有重要的意义。可喜的是，近年来人们认识到了蚕丝作为一种天然蛋白质宝库的价值。除了在家居和服饰领域，蚕丝在保健品、化妆品、食品、和生物医学材料等领域也成为了研究和应用的热点。蚕丝的主要组份是丝素和丝胶蛋白。丝素蛋白是一种纤维蛋白，是丝的核心成分，约占丝重的70～80％。丝胶是一种胶状的球蛋白，存在于丝素的外围，包被着丝素，对丝素起着保护和胶粘作用。丝素蛋白构成了蚕茧的骨架，而丝胶蛋白作为黏附的胶水，从而构建起了用于保护蚕体的蚕茧。蚕丝蛋白被认为具有抗菌、抗氧化和促进细胞增殖等特性，表明了蚕丝中可能还存在其他有生物学活性的蛋白质，但是关于它们的成分与特性还未见报道。蚕丝中活性蛋白的研究和应用对蚕丝的个性化、功能化和多元化利用具有重要意义，将显著提升蚕丝在多个行业领域的开发利用价值。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在制备抗真菌的药物中的应用，本专利技术的目的之二在于提供家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的分离方法；本专利技术的目的之三在于提供由上述方法分离获得的家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供如下技术方案：1、家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在制备抗真菌的药物中的应用。优选的，所述家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白。更优选的，所述家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂为如下SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21、SEQIDNO.22、SEQIDNO.23、SEQIDNO.24、SEQIDNO.25、SEQIDNO.26、SEQIDNO.27、SEQIDNO.28和SEQIDNO.29所示，具体如表1所示。最优选的，所述真菌为球孢白僵菌。2、家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的分离方法，包括如下步骤：将蚕茧分层、剪碎，然后加入pH7.5、50～100mM的Tris-HCl缓冲液，在18℃～37℃、在转速110～220rpm条件下提取15～30min；然后在18℃～25℃，转速为10000～14000rpm下离心10～15min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤后，收集滤液得家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂。本专利技术中，如果提取温度过高，提取时间过长，则得到的杂蛋白会变多，而抗真菌蛋白酶抑制剂的相对比例会变低。提取中将蚕茧分层的作用是得到不同品质的抗真菌蛋白酶抑制剂，其中从蚕茧外层提取的抗真菌蛋白酶抑制剂的种类和含量会相对较多，而从蚕茧内层提取的抗真菌蛋白酶抑制剂的种类和含量会相对较少。3、利用所述分离方法制备的家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂。本专利技术的有益效果在于：本专利技术首次发现了家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂具有抗真菌的活性，并且抗真菌蛋白酶的活性高，能够明显地抑制白色念球菌分泌的蛋白酶K的活性，还能抑制家蚕致病性真菌球孢白僵菌的孢子萌发；此外本专利技术分离的家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂稳定性高，在沸水中孵育10min后仍然保持活性；并且本专利技术家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂属于天然真菌蛋白酶抑制剂，对人、畜无毒害；还具有生产成本低的优点，本专利技术家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂利用了家蚕蚕茧这种丰富的动物纤维资源，为蚕丝的多元化利用提供了新的途径。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图：图1为蚕茧各茧层中真菌蛋白酶K抑制剂的活性染色。图2为与蚕茧各茧层中真菌蛋白酶抑制剂孵育后，球孢白僵菌孢子萌发率的变化。图3为煮沸处理的各茧层中真菌蛋白酶K抑制剂的活性染色。图4为煮沸处理的各茧层中真菌蛋白酶抑制剂孵育后，球孢白僵菌孢子萌发率的变化。具体实施方式下面将结合附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的分离方法将蚕茧分为6层，然后分别剪成细小的碎片，紫外灭菌过夜，加入适量的100mMTris-HCl(pH7.5)缓冲液，置于37℃下，在转速220rpm的摇床中提取30min；然后在室温(18～25℃)，转速为10000rpm下离心15min，取上清液，使用0.22μm滤膜过滤后，在-20℃保存。用BCA法，以牛血清白蛋白为标准，测定所提取到的蛋白在595nm处的吸光度，然后根据标准曲线计算，测得茧层1(最内层)到茧层6(最外层)的样品浓度为0.79、1.13、1.09、0.90、0.83和0.97mg/mL。再利用ThermoScientificQExactive质谱仪对从最外层蚕茧中提取出的蛋白质进行质谱鉴定，发现所提取的主要成分是29种蛋白酶抑制剂，占总蛋白含量的89％。将从最外层蚕茧中提取出的蛋白质进行煮沸处理后再进行质谱鉴定，结果显示煮沸处理的家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂主要成分是27种蛋白酶抑制剂，占总蛋白含量的93％。鉴定结果如表1所示：表1、家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂实施例2、测定家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的真菌蛋白酶K的抑制活性家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂对真菌蛋白酶K的抑制活性测定，具体步骤如下：(1)将实施例1提取的1～6层家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂(各5μg)经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶置于质量分数为0.07％的蛋白酶K溶液(100mMTris-HCl，pH7.5)中，37℃、60rpm摇床条件下避光振荡孵育20min；(2)除去蛋白酶K溶液，用MilliQ水清洗蛋白胶两次，室温静置15min；(3)加入质量分数为0.1％邻联茴香胺染色液(pH7.5，100mMTris-HCl缓冲液溶解)和0.2％N-乙酰-D,L-苯丙氨酸-β-aphthylester基质(由N，N’-二甲基甲酰胺溶解)的混合液染色，37℃、60rpm摇床条件下避光振荡孵育20min；(4)倒掉基质和染色液，加入MilliQ水清洗胶面，终止反应，被蛋白酶分解的基质能够将凝胶染成红色，而蛋白酶抑制剂所在的位置因蛋白酶的活性被抑制而不会被染上颜色。因此，蛋白酶抑制剂所在位置为白色条带，结果如图1所示。结果发现，从内茧层提取的蛋白酶抑制剂对真菌蛋白酶K的抑制活性较弱，从外茧层中提取的蛋白酶抑制剂对真菌蛋白酶K的抑制活性最强。实施例3、测定家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂对球孢白僵菌孢子萌发的抑制活性家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在制备抗真菌的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂在制备抗真菌的药物中的应用，其特征在于：所述家蚕蚕茧抗真菌蛋白酶抑制剂的分离方法包括如下步骤：将蚕茧分为6层并取最外层蚕茧、剪碎，然后加入pH7.5、100mM的Tris-HCl缓冲液，在37℃、转速220rpm条件下提取30min；然后在18℃～25℃，转速为10000rpm下离心15min，取上清液，用0.22μm滤膜过滤后，收集滤液得家蚕蚕茧蛋白酶抑制剂；所提取的主要成分是29种蛋白酶抑制剂，占总蛋白含量的89%，所述29种蛋白酶抑制剂氨基酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵萍，董照明，郭晓朦，张艳，夏庆友，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85