本发明专利技术公开了一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法，主要包括以下步骤：1)棉花主要病原真菌菌丝基因组DNA提取，包括大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌、粉红单端孢和尖孢镰刀菌；2)核糖体内部转录间隔区(ITS)PCR扩增，使用真菌ITS通用引物ITS4和ITS5进行快速扩增；3)限制性内切酶酶切反应，及带谱鉴别，任意使用识别位点为四碱基的内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A对上述棉花主要病原真菌的ITS产物进行单酶切，比对ITS-RFLP带谱对比表和标准电子图谱，从而快速鉴定出病原菌的类别。本发明专利技术较传统的费时费力形态学生理学鉴定，以及高成本的ITS克隆测序鉴定病原菌方法而言，具有快速、准确、经济且可以同时鉴定多种病原真菌的优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法，主要包括以下步骤：1)棉花主要病原真菌菌丝基因组DNA提取，包括大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌、粉红单端孢和尖孢镰刀菌；2)核糖体内部转录间隔区(ITS)PCR扩增，使用真菌ITS通用引物ITS4和ITS5进行快速扩增；3)限制性内切酶酶切反应，及带谱鉴别，任意使用识别位点为四碱基的内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A对上述棉花主要病原真菌的ITS产物进行单酶切，比对ITS-RFLP带谱对比表和标准电子图谱，从而快速鉴定出病原菌的类别。本专利技术较传统的费时费力形态学生理学鉴定，以及高成本的ITS克隆测序鉴定病原菌方法而言，具有快速、准确、经济且可以同时鉴定多种病原真菌的优点。【专利说明】一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法
本专利技术涉及植物病理学领域，具体地，本专利技术涉及一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法。
技术介绍
棉花是世界性重要的经济作物和纺织工业原料，也是关系国计民生的重要物资。长期以来，棉花病虫害的普遍发生始终是制约棉花高产的瓶颈问题，其中最为严重的当属黄萎病和枯萎病，其次为铃病和苗病，多为真菌病害。为了更加科学制定合理的防控措施，对病害种类的确认是最为必要的前提，因此快速准确鉴定病原菌就显得尤为重要。棉花病原真菌传统的鉴定是以形态学、细胞学、生理学和生态学等特征为根据的，但是由于很多真菌生物学性状极其相似，因此，要求科研工作者具有丰富的实践经验，同时，传统的鉴定还较为费时、费力。随着分子生物学的发展，核糖体内部转录间隔区(Internal transcribed spacer, ITS)扩增、克隆测序,大大提高了病原真菌鉴定的准确性，但仍存在实验周期较长，成本较高的问题。完成ITS克隆、测序、比对一系列程序需要大约一周，且一个样品的鉴定费用大约是40元。虽然采用ITS-RFLP方法鉴定病原真菌已经有文献进行报道，由于棉花病原真菌基因上的相似性，存在严重的相互干扰，因此如何针对棉花病原真菌的特点，选择合适的引物以及内切酶来提高鉴定的准确性仍然是本领域的技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法，快速而又准确的鉴定棉花病原真菌的种类，为病害的有效防控提供依据。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种棉花主要病原真菌ITS-RFLP快速鉴定方法，选择棉花主要病害的病原真菌，包括棉花黄萎病、枯萎病、立枯病、红腐病和红粉病所对应的病原菌大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌和粉红单端孢，并测定以上病原真菌的ITS序列；利用Webcutter在线分析选择酶切带谱类型各异的限制性内切酶Hha1、HaeII1、Taq1、Sau3A，结合pDRAW32软件，对酶切产物分布情况进行分析，并绘制出2-4%的琼脂糖凝胶电子酶切图谱，作为比对使用的标准图谱；随后提取待测棉花样品的病原真菌的基因组DNA，采用如下引物对所提取的DNA进行PCR扩增；ITS4:5，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，:ITS5:5’ -GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’:扩增产物使用限制性内切酶Hha1、HaeII1、Taq1、Sau3A分别酶切，并采用与前述琼脂糖凝胶相同浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，并将酶切结果和电子标准图谱比对，鉴定病原真菌种类。 其特征在于包括下述步骤:表1棉花主要病害和病原真菌列表棉花病害病原菌名称(中文)病原菌学名(拉丁文)缩写棉花黄萎病大刚轮 枝菌VerticUlium dahliaeVd棉花黄萎病黑白轮枝菌VerticilIium albo-atrumVa棉花立枯病立枯丝核菌Rhizoctonia solaniRs棉花红腐病串珠镰刀菌Fusarium proliferatumFp棉花红粉病粉红单端抱Trichothecium roseumTr棉^才古豸胃_尖孢镰刀菌_Fusarium oxysporumFo在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的鉴定步骤包括如下步骤:DDNA的提取:将分离纯化的棉花病原真菌接种至PDA培养基，28°C恒温静置培养，收集菌丝，收集棉花病原真菌的菌丝，采用CTAB-NaCl方法抽提，用ddH20溶解基因组DNA2)PCR扩增:以上述病原真菌的基因组DNA为模板，采用引物对ITS4 5’ -TCC TCCGCT TAT TGA TAT GC-3，和 ITS5 5，-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3，进行 PCR 扩增。20 μ I 的 PCR 反应体系:包括 10 X PCR buffer (Mg2+) 2 μ I，浓度为 IOmM 的 dNTP 溶液 1.6 μ I，浓度为IOuM引物ITS4 / ITS5各lμl，基因组DNAlμl，浓度为5U / μ I的Taq酶0.2 μ 1，以及13.2μ I的ddH20。扩增反应程序为:94°C预变性2min，之后，94°C变性30s，50。。退火30s，72°C延伸40s，共25个循环，最后72°C延伸lOmin，得到ITS的PCR产物，产物大小范围为 500-750bp。3)酶切反应:任意使用限制性内切酶Hha1、HaeII1、Taq1、Sau3A对ITS的PCR产物酶切。10 μ I的酶切体系:1TS模板6μ 1，10Χ内切酶bufferly 1，内切酶0.5 μ l、ddH202.5 μ I。反应条件为:PCR仪中37°C保温lh，加入2μ I的6Xloading buffer终止反应，3%琼脂糖凝胶电泳恒压75V，2小时，在紫外灯下观察拍照，获得ITS-RFLP带谱；4)带谱鉴别:将上述获得的ITS-RFLP带谱和标准电子酶切图谱比对，首先比对HhaI和Sau3A对应的大小和电子图谱(如表2和图3)，以粉红单端孢(Tr)为例，用HhaI酶切后，如果出现四条泳带，且最大为295bp,最小为23bp,则说明是Tr,与此同时结合Sau3A的酶切结果，显示出有两条泳带，分别是396bp和190bp，就进一步确认待鉴定菌株为粉红单端孢。本专利技术提供了 6种棉花病原真菌的4种常用内切酶的带谱对比表和电子图谱，以便实现准确鉴定的目的。表2棉花病原菌ITS-RFLP带谱对比表(bp)病原菌 ITS 大小 HhaI HaeTTITaqlSau3A ~Vd 546 113+198+235 55+59+57+375 25+59+72+182+208 6+52+164+324~ Va 512 243+269 28+29+150+305 3+59+72+158+220 51+142+144+175 Rs 708 345+363 708 708 5+28+156+241+244 Fp 532 94+174+264 77+83十91+281 94+174+264 52+53+110+143+174 Tr 586 23+74+194+295 45+48+64+85+344 142+404 190+396 _Fo_517_262+250本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种棉花主要病原真菌ITS?RFLP快速鉴定方法，选择棉花主要病害的病原真菌，包括棉花黄萎病、枯萎病、立枯病、红腐病和红粉病所对应的病原菌大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌和粉红单端孢，并测定以上病原真菌的ITS序列；利用Webcutter在线分析选择酶切带谱类型各异的限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A，结合pDRAW32软件，对酶切产物分布情况进行分析，并绘制出2?4％的琼脂糖凝胶电子酶切图谱，作为比对使用的标准图谱；随后提取待测棉花样品的病原真菌的基因组DNA，采用如下引物对所提取的DNA进行PCR扩增；ITS4：5’?TCC?TCC?GCT?TAT?TGA?TAT?GC?3’：ITS5：5’?GGA?AGT?AAA?AGT?CGT?AAC?AAG?G?3’：扩增产物使用限制性内切酶HhaI、HaeIII、TaqI、Sau3A分别酶切，并采用与前述琼脂糖凝胶相同浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，并将酶切结果和电子标准图谱比对，鉴定病原真菌种类。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李志芳，朱荷琴，冯自力，赵丽红，师勇强，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：
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